核酸第二部分描述

流感病毒核酸（RNA）提取1
目的：
富集靶核酸浓度 ★ 保证靶核酸序列的完整性 ★ 增加PCR模板溶液均一性 ★ 去除PCR抑制物
★
分析性能评估
流感病毒核酸（RNA）提取2
RNA分离纯化方法：

分析性能评估
传统方法vs改良方法 满足试剂的性能需要 提供详细的验证资料。
最低检测限ຫໍສະໝຸດ Baidu分析灵敏度）（1）
★
最低检测限设定--举例1
From 《H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERT》· American
最低检测限设定--举例2
From 《H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERT》· American
最低检测限设定--举例3
From 《H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERT》· American
类型
3型
7型
微生物
棒状杆菌*
大肠杆菌* 流感嗜血杆菌 乳杆菌* 卡他莫拉菌* 无毒结核分枝杆菌 肺炎支原体 脑膜炎奈瑟菌 淋球菌* 铜绿假单胞菌* 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌* 肺炎链球菌 化脓链球菌 唾液链球菌
类型
*项：选择性验证
分析特异性 (2)
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分析性能评估
交叉反应
★
病原体滴度水平：医学相关水平，细菌为106 cfu/ml或更高，病毒为105 pfu/ml或更高 产品说明书【产品性能指标】项。
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分析性能评估
参考：CLSI-EP文件、国内有关IVD产品性能评估 文件 可能影响检测精密度的主要变量：试剂、PCR分 析仪、操作者、地点等
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精密度（2）
★ ★
分析性能评估
指标：批内/间、日内/间以及总的CV等 评价方案：企业自定合理方案 例如：连续20天（工作日），每天由2人完成不 少于2次的完整检测
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分析性能评估
最低检测限的确定
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培养后病毒原液的梯度稀释液 病毒滴度的滴定：推荐采用半数组织培养感染 量(TCID50）、copies/ml、空斑形成单位 （PFU）
最低检测限（分析灵敏度）（1）
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分析性能评估
最低检测限的确定
每个梯度重复3-5份 ★ 90%-95%阳性检出率--最低检测限。
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最低检测限（分析灵敏度）（2）
★
分析性能评估
最低检测限的确定
至少5份最低检测限水平的病毒稀释液对90%95%的检出率进行确认。 ★ 常见各甲型亚型和乙型流感病毒应至少包括不 同来源的两个具有代表性的病毒株的系列稀释 梯度。
★
最低检测限（分析灵敏度） （3）
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分析性能评估
最低检测限的验证
接近最低检测限的病毒浓度 ★ 每种亚型具有时间和/或区域多样性的至少3个 毒株 ★ 如含疫苗株，应能体现当年流感发病季的病毒 特点。
最低检测限设定--举例4
From 《H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERT》· American
最低检测限设定--举例5
From 《H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERT》· American
最低检测限设定--举例6
From 《H1N1-09 INFLUENZA TEST PACKAGE INSERT》· American
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工艺及反应体系研究（3）
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RT-PCR体系优化： 靶序列选择 引物、探针序列 各组分浓度 Tm值、PCR各阶段温度、时间等
工艺及反应体系研究（3）
基线（threshold）和阈值循环数（Ct） 确定 ★ 适用机型选择 ★ 考虑多探针识别靶核酸 eg：H1+N1；巢式PCR（H1序列）
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工艺及反应体系研究（4）
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分析特异性 (3)
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分析性能评估
干扰物质 （表2） 血液、鼻分泌物或粘液、用于缓解鼻塞和 咽部充血、鼻腔干燥、刺激、哮喘和过敏 症状的药物。
分析性能评估
表2 建议用于干扰研究的物质
物质
粘蛋白 人血液 鼻腔喷雾剂或滴鼻剂 鼻腔糖皮质激素 肾上腺素、羟甲唑啉、含防腐剂的氯化钠溶液 倍氯米松、地塞米松、氟尼缩松、曲安西龙、布 地奈德、莫美他松、氟替卡松 硫磺 纯化粘蛋白
流行性感冒病毒核酸检测试剂注册申报 资料技术审评指导原则（报批稿）
第二部分
2011.10 广西
工艺及反应体系研究（1）
★
生产工艺：
工作液配制、半成品检定、分装和包装等
★
生产工艺要求：
原材料及其配比要求，
物理参数：pH、电导率等要求
工艺及反应体系研究（2）
主要生产工艺介绍，可以图表方式 表示 ★ 反应原理介绍 ★ 基因位点选择、RT-PCR方法学特性 介绍
活性成分
鼻用凝胶
过敏性症状缓解药物
润喉片、口服麻醉剂和镇痛剂 抗病毒药物 抗生素、鼻用软膏 全身抗菌药
金英
苯唑卡因、薄荷脑 扎那米韦 莫匹罗星 妥布霉素
分析特异性 (4)
★ 干扰物浓度：
分析性能评估
医学相关水平 潜在最大浓度(“最差条件”)
★ 流感病毒：
每种亚型的至少两种病毒株 最低检测限水平。
精密度（1）
分析特异性 (1)
★
分析性能评估
交叉反应
流感病毒：不同型别和亚型间 ★ 其他病原体（表1）：
★
核酸序列具有同源性 易引起相同或相似的临床症状 采样部位正常寄生或易并发的其他微生物
分析性能评估
表1 建议用于交叉反应性研究的微生物
微生物
腺病毒
腺病毒 人冠状病毒 巨细胞病毒 肠道病毒 人副流感病毒 人副流感病毒 人副流感病毒 麻疹病毒 人偏肺病毒 流行性腮腺炎病毒 呼吸道合胞病毒 鼻病毒 百日咳杆菌 肺炎衣原体 B型 1A型 1型 2型 3型
工艺及反应体系研究（7）
对照品的原料选择： ★ 内对照（内标）：具有蛋白外壳的病毒颗 粒，如灭活的流感病毒或缺陷病毒（假病 毒）； ★ 外部阳性对照：可以采用灭活病毒、假病 毒或质粒。
分析性能评估
产品研制阶段对试剂盒进行的所有 性能验证的研究资料，包括各性能的标 准要求、具体研究方法、试验数据、统 计方法等详细资料 建议对实验地点、操作人员、适用 机型、实验条件等背景信息也作简单介 绍。
外部对照（质控）品： ★ 至少包括临界阳性和阴性对照（质控）品； ★ 均应参与样本核酸的平行提取
工艺及反应体系研究（5）
★ 各种对照（质控）品的Ct值
★ 阴性对照品：推荐采用与实际检测样本
具有相同或相似性状的基质溶液
工艺及反应体系研究（6）
内对照（内标）： ★ 必须设臵（竞争或非竞争） ★ 对内标的引物、探针和模板的浓度做精 确验证 ★ Ct值要求。