芥子油苷测定方法

高效液相色谱对芥子油苷的提取和分离

I准备阶段:

1.水浴锅设置80℃

2.配制两瓶70%的甲醇，其中一瓶置于水浴锅中温浴。

3.5mM苄基芥子油昔.2.33mg/ml

4.0.5M 醋酸盐(PH=5)[30mlHAC，960ml H2O，力口10-20g NaOH 粉末，调至PH=5]

5.20mM的醋酸盐，PH=5：将4中的稀释25倍

6.DEAE sephadex A-25 :称取3g 树脂，加90ml 0.5M 醋酸盐(PH=5)室温过夜溶解。

7.硫酸酯酶：15mg溶解于6ml 20mM 醋酸钠中，PH=5 (16100uM/hour/g )

II芥子油提取

1.取新鲜莲座叶，鲜重5-10mg

2.放入1.5mlEP管中，迅速放入液氮。

3.研磨成粉末后并加入1ml预热的70%的甲醇。

4.加入50ul 5mM的苄基芥子油昔

5.盖好盖子漩涡震荡置于冰上，剩下的样品重复步骤3-4。

6.所有的样品置于80℃10min。

7. 4000rpm, 10min。

8.将上清液转移至1.5的离心管。

9.用预热的甲醇重新提取两次，收集所有的上清液至4ml, -20℃

保存。

m芥子油苷的脱硫纯化

1.搅拌DEAE sephadex A-25树脂成溶液，用1ml的移液器取1ml

加入BioRad管中，让其沉淀。

2.用5ml的灭菌水清洗（禁止干燥）。

3.加入所有的芥子油昔提取液。

4.用2ml的70%的甲醇清洗两次，2ml的灭菌水清洗5次，2ml 20mM 醋酸盐PH=5清洗一次。

5.加入0.5ml硫酸酯酶，直至上侧的橡胶管中剩余1-2mm的液相。

IV脱硫芥子油苷的洗脱

1.用1ml灭菌水洗脱3次。

2.浓缩至EP管中剩余0.5ml液体

V HPLC分离脱硫芥子油苷

1.取60ul洗脱液于HPLC管中，吸入30ul

2.检测：PDA 190nm-370nm （或者DV229nm 和260nm）

3.流速：1ml/min

4.运行梯度：灭菌水（A）和甲醇（B），60min

A100%,B0% 2min

A to 60%

B 线性48min，60%B to 100% B 线性3min

A 0%，B100% 3min

B to 100% A 线性4min

VI芥子油苷的HPLC-MS

5 .取60ul 洗脱液加入HPLC 管中，吸入6ul

6 .检测：质谱，[M+Na +]

7 .流速：0.25ml/min

8 .运行梯度：混有50uM 的醋酸钠灭菌水(A )与甲醇(B ), 60min 40min ，60%B to 100% B 线性 5min

A 0%，B100% 5min

B to 100% A 线性

8min 液相色谱质谱联用分离、鉴定芥蓝中脱硫芥子油昔

腊贵晓,方萍,李亚娟,王月

1 .芥子油昔的提取和纯化

称取0. 20 g 冻干样品，加入3 mL 70%甲醇(甲醇：水二70 ： 30), 在70℃的水浴锅中提取10 min,然后4000 r min- 1离心10 min. 沉淀再按照上述方法提取2次,合并上述提取液.同时做2个平行.取 2 mL 提取液流经DEAESephadex A-25萃取柱，待提取液全部流出小柱 后，加入200 L 硫酸酯酶(0. 1%)溶液.室温反应16 h 后用4X 0. 5 mL 超纯水洗脱.洗脱液过0. 45 〃 m 微膜,4℃下保存,待HPLC 分析.利用 2-丙烯基芥子油昔(sinigrin)作为外标进行定量.

2 .芥子油昔的测定与鉴定

测定芥子油昔的主要方法包括气相色谱法测定其降解产物异硫代氰 酸盐化合物;高效液相色谱法测定脱硫芥子油昔和完形芥子油昔.对 芥子油昔的鉴定一般采用质谱法,包括化学电离、快速原子轰击电离

A100%,B0%

2min

A to 60%

B 线性

及热喷雾电离等方法.

1.超高效液相色谱法测定拟南芥芥子油昔［J］东北农业大学学报，石璐，李梦莎，国静等摘要：将已有的拟南芥芥子油昔高效液相色谱(HPLC)检测方法转换为超高效液相色谱

(UPLC)方法，通过条件优化改进，建立拟南芥芥子油昔UPLC检测方法。该方法采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(50 mmX2.1 mm, 1.8 p m),以超纯水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，流速为0.40 mL-min-1,检测波长229 nm,进样量5 p L,内标为苯甲基芥子油昔。

2.芥蓝芥子油昔提取条件优化研究

腊贵晓1,孔海民2,方萍3,杨铁钢1*

摘要:采用正交试验设计，研究了提取温度、提取剂甲醇浓度(V/V)、提取时间和待测物质与提取液比例(简称“物液比”)对芥蓝菜薹中芥子油苷(总芥子油昔含量、总脂肪族芥子油苷和总吲哚族芥子油甘)提取效果的影响。结果表明，物液比和提取温度对总芥子油昔、总脂肪族芥子油昔和总吲哚族芥子油昔提取效果影响显著(P<0. 05)，而甲醇浓度和提取时间对芥子油昔提取率无显著影响(P>0.

05)。综合考虑提取效果和成本，芥蓝中芥子油昔最佳提取条件为75℃,物液比1 ：45( g : mL),甲醇浓度70%,提取时间5 min。在该条件下，总芥子油昔提取量为8. 31 p mol/g DW,总脂肪族芥子油昔提取总量为7. 58 p mol/g DW,总吲哚族脂肪族芥子油昔提取总量为0. 73 p mol/g DW。

3.中国甘蓝型油菜硫甘含量及组份分析

李培武1, 2,赵永国2,张文2,丁小霞2,杨湄3,汪雪芳3,谢从华1,傅廷栋1 (1)硫昔提取：准确称取0.2000 g已制备好的样品至离心管中，于75℃水浴中保温杀活1 min,加入2 ml 70%甲醇提取液和200 pl内标，离心、转移上清液至试管中，再加入2ml 70% 甲醇提取并离心，共重复3次，混合上清液，取2 ml溶液上醋酸型DEAE-Sephadex A-25 阴离子交换柱，加硫酸酯酶500 pl,于36℃培养箱中酶解20 h后取出，用1 ml纯水冲洗，待流干后再用1 ml纯水冲洗，共冲洗3次，混匀收集的洗脱液，用0.45 pm的微孔滤膜过滤、封口，待上液相色谱仪分析。

(2)高效液相色谱分析：使用美国Waters公司的液相色谱仪，包括两台高压泵，自动进样器，二极管阵列检测器，色谱柱为Spherisorb C18柱(150 mmX4 mm),流动相为20% 乙腈，检测波长229 nm,柱温为30℃,进样量10 pl,所有样品重复2次，按照国际标准方法进行硫昔分量色谱峰定性。

青花菜：在青花菜芽菜中共发现了 7种芥子油苷，3种脂肪类芥子

油苷，S4,S5和T4以及4种“吲哚类芥子油苷” :4OHIM, IM,1IM和