布氏白僵菌和金龟子绿僵菌两变种的生长性状及其对蛴螬的毒力测定
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地下害虫蛴螬可为害多种农作物 ,防治的难度很大 。与现有化学防治手段相比 ,利用微生 物防治蛴螬更符合安全食品生产的要求 ,是实现花生等根茎作物无公害生产的必由之路 。利 用昆虫病原真菌防治蛴螬早已引起重视 ,1879 年俄国的梅契尼可夫 (Metchnikoff) 发现并利用金 龟子绿僵菌 ( Metarhizium anisopliae) 防治奥地利赛丽金龟 ( Anisoplia austriaca) 的经典试验 ,揭 开了微生物防治害虫的序幕[1] 。目前很多国家已开发出商品性真菌杀虫剂用于防治蛴螬 。我国 利用布氏白僵菌 ( Beauveria brongniartii Petch) [2] 、金龟子绿僵菌[1]等防治蛴螬也取得了较好的 效果 ,但尚未研发出防治蛴螬的商品杀虫剂 。寻找高毒力的致病真菌 ,是对其进一步开发应用 的前提 。 作者于 2003 年 11 月从安徽肥西收集的蛴螬中分离到一种病原真菌 ,初步鉴定为绿僵菌 大孢变种 ( M . anisopliae var. major , Ma1) 。本试验将该菌种与实验室保存的绿僵菌小孢变种 ( M . anisopliae var. anisopliae , Ma3) ,以及布氏白僵菌 (Bbr) 进行了生物学特性观察与测定 ,并 将绿僵菌大孢变种 、布氏白僵菌对蛴螬的毒力进行了比较 。
2 结果与分析
211 不同培养基上菌落的形态特征
同种真菌在 PPDA 、Czapek 、SDAY这 3 种培养基上形态变化不大 ,但不同种之间差异明显 。
在 25 ℃下培养 14d 后 ,3 菌株的菌落特征如表 1 (以 SDAY平板上的培养特征为代表) 。
表 1 三种虫生真菌的菌落形态特征
(安徽农业大学植保学院 , 合肥 230036)
摘要 : 以蛴螬病原真菌 ———布氏白僵菌 、绿僵菌小孢变种作参照菌 ,研究了新分离鉴定的绿僵 菌大孢变种的生物学特性 ,测定了不同温度 、不同培养基条件下各菌株对蛴螬的致病能力 。结 果表明 :绿僵菌大孢变种与两种参照菌的培养条件接近 ,最适宜生长的温度为 25 ℃,所试的 3 种培养基中 ,最适宜的培养基为 PPDA ,其次为 SDAY;绿僵菌大孢变种在偏低温 (10～20 ℃) 的 环境下对蛴螬的毒杀能力比布氏白僵菌强 , 土壤处理和喷雾处理后 , 累计僵虫率分别达 88123 %和 76147 % ,有很好的田间应用前景 。两种真菌的拌土处理效果高于直接喷雾 。鉴于 绿僵菌 Ma1 的致病力较强 ,在生产上可用该菌进行土壤处理 ,防治蛴螬等地下害虫 。
22 (2) 123 - 127 中国生物防治 Chinese Journal of Biological Control 2006 年 5 月
布氏白僵菌和金龟子绿僵菌两变种的 生长性状及其对蛴螬的毒力测定
林华峰 3 , 王萍莉 , 张 磊 , 杨新军 , 李世广 , 周义文
LIN hua2feng , WANG Ping2li , ZHANG Lei , YANG Xin2jun , LI Shi2guang , ZHOU Yi2wen
(College of Plant Protection , Anhui Agricultural University , Hefei 230036 , China)
黄褐色 黄褐色
孢子粉 色泽 粉白色
橄榄绿色 黄绿色
212 不同温度对三菌株菌落的影响 在 SDAY培养平板上 ,3 菌株的生长速度不一致 ,点滴接种恒温培养箱中培养 6d 后 ,Bbr 的 菌落面积已占整个平板面积的 8613 % ;而 Ma1 和 Ma3 到第 8d 才分别占 7516 %和 8011 %。3 菌 株在接种 3～7d 里菌丝生长最快 。其中 , 25 ℃下菌落生长速度最快 ,Bbr 在 25 ℃下要比 15 ℃下 提前 4d 产孢 ;Ma1 提前 5d 产孢 ;而 Ma3 提前 6d 产孢 。温度太高也会抑制其产孢 ,使其产孢滞 后 。以 25 ℃对 3 菌株生长最为适宜 (表 2) 。
1 材料与方法
111 供试菌种与培养基 布氏白僵菌和金龟子绿僵菌两个变种 (大孢变种和小孢变种) 来源见表 1 。其培养采用萨 氏葡萄糖酵母浸膏培养基 (SDAY) 、蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ( PPDA) 和察氏琼脂培养 基 (Czapek) [1 ] 。 112 菌落培养特征 在 SDAY、PPDA 和 Czapek 培养基上分别用菌液点滴法接种 , 将供试真菌分生孢子用 015 %吐温280 配成 110 ×108 个/ ml 孢子悬浮液 ,用 40μl 的微量移液管滴在培养平板表面 ,共 3 点 ,呈三角形排列 ,每点呈一个圆形接种面 ,每点接种菌液为 10μl ,每菌株接 4 皿 。接种后 ,每 两天观测一次 ,记录菌落的形态 、颜色 、质地及菌落面积 ,并对不同培养阶段 、不同温度条件下 的培养形状进行比较 。 113 不同温度对菌株菌落生长速度及其孢子萌发率的影响 用微量移液管滴菌液于 SDAY 培养基上 ,所接菌种分别置于 15 、25 和 30 ℃的光照培养箱 培养 。从长成菌落开始 ,每两天测量一次菌落纵横两个方向的直径 ,取其平均值 ,计算出每日 菌落直径增长量 。取各菌株孢子 01005g 放入培养液 (1g 葡萄糖和 1g 蛋白胨 ,100ml 水) 中振荡 15min ,25 ℃恒温箱中光照培养 。每隔 24h 镜检一次孢子的萌发率 (在光学显微镜下 10 个视野 中发芽孢子数占总孢子数的百分比) 。 114 不同培养基对菌株菌落生长速度的影响 将 SDAY、PPDA 和 Czapek 培养基上所接菌种置于 25 ℃恒温培养箱中光照培养 。测定方 法同 113 。 115 两种虫生真菌对蛴螬的毒力测定 华北大黑鳃金龟 ( Holotrichia oblita) 的 3 龄越冬幼虫 (蛴螬) 采自安徽肥西县花生田的自 然种群 。采用喷雾法和土壤处理法对虫体进行接菌 。喷雾法 :用手持喷雾器将配成 108 个孢 子/ ml 浓度的菌悬液喷遍蛴螬虫体 ,让其自由爬行片刻后 ,移入罐头瓶中装土饲养 。土壤处理 法 :用 108 个孢子/ ml 浓度的菌悬液拌土 ,每罐头瓶内土壤用药 10ml ,相当于田间每穴的用量 。
grub
收稿日期 :2005204226 基金项目 :国家自然科学基金重点项目 (30330500) ;安徽省学术带头人项目 (2002HBL17) 作者简介 :林华峰 (1957 - ) ,男 ,博士 ,教授 , 3 通讯作者 ,E2mail :hf . lin @1631com。
123
中 国 生 物 防 治 第 22 卷
Abstract : Metarhizium anisopliae var. major isolated from white grubs was tested for its biological char2 acteristics , culture conditions and virulence to white grubs. Results showed that the optimal cultural con2 dition of M . anisopliae var. major was similar to those of Beauveria brongniartii and M . anisopliae var. anisoplia. The most appropriate temperature for growth of M . anisopliae var. major was 25 ℃; the appropriate media for growth were PPDA , SDAY , and Czapek in order ; virulence of the isolate to white grubs was stronger than that of B . brongniartii at lower temperature (10 - 20 ℃) with adjusted accumula2 tive mortality rates of 88. 23 % and 76. 47 % , by mixing into and spraying onto soil , respectively. Indi2 cating that M . anisopliae var. major is very good candidate for control of white grubs. Key words : Beauveria brongniartii ; Metarhizium anisopliae ; biological properties ; virulence ; white
表 2 三株真菌菌落在不同温度下的生长速度( SDAY) 及其孢子的萌发率
菌株
Bbr Ma1 Ma3
菌落直径日增量 ( %)
15 ℃
25 ℃
30 ℃
6107 f
14139 a 10123 c
0135 h
9159 d
6114 f
3125 g
10190 b
8115 e
开始产孢所需时间 (d)
15 ℃
25 ℃
213 不同培养基对菌落生长速度的影响 在 3 种不同培养基上常温 (25 ℃) 培养两株绿僵菌 ,在 PPDA 上的生长速度最快 ,两菌株初 始产孢日期要比在 SDAY和 Czapek 两种培养基上培养的提前 1～2d 。表明 Ma3 和 Ma1 两株真 菌在 PPDA 培养基上最适宜生长和繁殖 ,其次为 SDAY(表 3) 。
菌株名称
布氏白僵菌 绿僵菌大孢变种 绿僵菌Байду номын сангаас孢变种
菌株 代号
原寄主
Bbr 不详
Ma1 华北大黑鳃金龟 Holotrichia oblita
Ma3 金头蚤跳甲 Psylliodes chrysocephala
来源地 菌落色泽
吉林
黄白色
安徽肥西 墨绿色
英国
淡黄绿色
菌落 形态 薄粉状
绒毛状 绒毛状
基质 色泽 桔黄色
124
第 2 期 林华峰等 :布氏白僵菌和金龟子绿僵菌两变种的生长性状及其对蛴螬的毒力测定
试验设 4 个处理 ,以不用药为对照 (表 4) 。每瓶饲养一头蛴螬 ,置于养虫室内 ,保持自然温度 (5 月份 ,10～20 ℃) ,适当保湿 。每处理 30 头蛴螬 ,3 次重复 。处理后每 3d 观测一次 ,记录死 亡虫数 ,并对死虫体进行保湿培养 ( > RH90 %) ,观察其是否变为僵虫 。共观测 18d 。根据每处 理每 3d 的虫口死亡数 ,计算累计死亡率和校正累计死亡率 。 116 数据处理 以 LT50 、校正死亡率以及僵虫率作为对害虫毒力分析的指标 ,将观察时间分为 6 个间隔 相等的时间区段 ,分别统计 、整理每个时间区段内的累计死亡率 ,并校正 ,以时间 (d) 的对数值 为 X ,死亡率的几率值为 Y , 采用几率值分析法[1]计算毒力回归方程和 LT50值 。
30 ℃
712 c
311 f
514 d
910 a
411 e
812 b
912 a
314 f
618 c
孢子萌发率 ( %)
24h
48h
72h
6011 f
7213 e
8018 d
4013 g
8918 c
9213 ab
4115 g
9112 bc 9315 a
注 :表中字母相同表示 0105 水平上差异不显著 ,字母不同表示差异显著 ,下同 。
关 键 词 : 布氏白僵菌 ; 金龟子绿僵菌 ; 生物学性状 ; 致病力 ; 蛴螬 中图分类号 : S433183 ; S476112 文献标识码 : A 文章编号 : 100529261 (2006) 0220123205
Growth of Beauveria brongniartii and Two Varieties of Metarhizium anisopliae and Their Virulence against White Grubs
2 结果与分析
211 不同培养基上菌落的形态特征
同种真菌在 PPDA 、Czapek 、SDAY这 3 种培养基上形态变化不大 ,但不同种之间差异明显 。
在 25 ℃下培养 14d 后 ,3 菌株的菌落特征如表 1 (以 SDAY平板上的培养特征为代表) 。
表 1 三种虫生真菌的菌落形态特征
(安徽农业大学植保学院 , 合肥 230036)
摘要 : 以蛴螬病原真菌 ———布氏白僵菌 、绿僵菌小孢变种作参照菌 ,研究了新分离鉴定的绿僵 菌大孢变种的生物学特性 ,测定了不同温度 、不同培养基条件下各菌株对蛴螬的致病能力 。结 果表明 :绿僵菌大孢变种与两种参照菌的培养条件接近 ,最适宜生长的温度为 25 ℃,所试的 3 种培养基中 ,最适宜的培养基为 PPDA ,其次为 SDAY;绿僵菌大孢变种在偏低温 (10～20 ℃) 的 环境下对蛴螬的毒杀能力比布氏白僵菌强 , 土壤处理和喷雾处理后 , 累计僵虫率分别达 88123 %和 76147 % ,有很好的田间应用前景 。两种真菌的拌土处理效果高于直接喷雾 。鉴于 绿僵菌 Ma1 的致病力较强 ,在生产上可用该菌进行土壤处理 ,防治蛴螬等地下害虫 。
22 (2) 123 - 127 中国生物防治 Chinese Journal of Biological Control 2006 年 5 月
布氏白僵菌和金龟子绿僵菌两变种的 生长性状及其对蛴螬的毒力测定
林华峰 3 , 王萍莉 , 张 磊 , 杨新军 , 李世广 , 周义文
LIN hua2feng , WANG Ping2li , ZHANG Lei , YANG Xin2jun , LI Shi2guang , ZHOU Yi2wen
(College of Plant Protection , Anhui Agricultural University , Hefei 230036 , China)
黄褐色 黄褐色
孢子粉 色泽 粉白色
橄榄绿色 黄绿色
212 不同温度对三菌株菌落的影响 在 SDAY培养平板上 ,3 菌株的生长速度不一致 ,点滴接种恒温培养箱中培养 6d 后 ,Bbr 的 菌落面积已占整个平板面积的 8613 % ;而 Ma1 和 Ma3 到第 8d 才分别占 7516 %和 8011 %。3 菌 株在接种 3～7d 里菌丝生长最快 。其中 , 25 ℃下菌落生长速度最快 ,Bbr 在 25 ℃下要比 15 ℃下 提前 4d 产孢 ;Ma1 提前 5d 产孢 ;而 Ma3 提前 6d 产孢 。温度太高也会抑制其产孢 ,使其产孢滞 后 。以 25 ℃对 3 菌株生长最为适宜 (表 2) 。
1 材料与方法
111 供试菌种与培养基 布氏白僵菌和金龟子绿僵菌两个变种 (大孢变种和小孢变种) 来源见表 1 。其培养采用萨 氏葡萄糖酵母浸膏培养基 (SDAY) 、蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ( PPDA) 和察氏琼脂培养 基 (Czapek) [1 ] 。 112 菌落培养特征 在 SDAY、PPDA 和 Czapek 培养基上分别用菌液点滴法接种 , 将供试真菌分生孢子用 015 %吐温280 配成 110 ×108 个/ ml 孢子悬浮液 ,用 40μl 的微量移液管滴在培养平板表面 ,共 3 点 ,呈三角形排列 ,每点呈一个圆形接种面 ,每点接种菌液为 10μl ,每菌株接 4 皿 。接种后 ,每 两天观测一次 ,记录菌落的形态 、颜色 、质地及菌落面积 ,并对不同培养阶段 、不同温度条件下 的培养形状进行比较 。 113 不同温度对菌株菌落生长速度及其孢子萌发率的影响 用微量移液管滴菌液于 SDAY 培养基上 ,所接菌种分别置于 15 、25 和 30 ℃的光照培养箱 培养 。从长成菌落开始 ,每两天测量一次菌落纵横两个方向的直径 ,取其平均值 ,计算出每日 菌落直径增长量 。取各菌株孢子 01005g 放入培养液 (1g 葡萄糖和 1g 蛋白胨 ,100ml 水) 中振荡 15min ,25 ℃恒温箱中光照培养 。每隔 24h 镜检一次孢子的萌发率 (在光学显微镜下 10 个视野 中发芽孢子数占总孢子数的百分比) 。 114 不同培养基对菌株菌落生长速度的影响 将 SDAY、PPDA 和 Czapek 培养基上所接菌种置于 25 ℃恒温培养箱中光照培养 。测定方 法同 113 。 115 两种虫生真菌对蛴螬的毒力测定 华北大黑鳃金龟 ( Holotrichia oblita) 的 3 龄越冬幼虫 (蛴螬) 采自安徽肥西县花生田的自 然种群 。采用喷雾法和土壤处理法对虫体进行接菌 。喷雾法 :用手持喷雾器将配成 108 个孢 子/ ml 浓度的菌悬液喷遍蛴螬虫体 ,让其自由爬行片刻后 ,移入罐头瓶中装土饲养 。土壤处理 法 :用 108 个孢子/ ml 浓度的菌悬液拌土 ,每罐头瓶内土壤用药 10ml ,相当于田间每穴的用量 。
grub
收稿日期 :2005204226 基金项目 :国家自然科学基金重点项目 (30330500) ;安徽省学术带头人项目 (2002HBL17) 作者简介 :林华峰 (1957 - ) ,男 ,博士 ,教授 , 3 通讯作者 ,E2mail :hf . lin @1631com。
123
中 国 生 物 防 治 第 22 卷
Abstract : Metarhizium anisopliae var. major isolated from white grubs was tested for its biological char2 acteristics , culture conditions and virulence to white grubs. Results showed that the optimal cultural con2 dition of M . anisopliae var. major was similar to those of Beauveria brongniartii and M . anisopliae var. anisoplia. The most appropriate temperature for growth of M . anisopliae var. major was 25 ℃; the appropriate media for growth were PPDA , SDAY , and Czapek in order ; virulence of the isolate to white grubs was stronger than that of B . brongniartii at lower temperature (10 - 20 ℃) with adjusted accumula2 tive mortality rates of 88. 23 % and 76. 47 % , by mixing into and spraying onto soil , respectively. Indi2 cating that M . anisopliae var. major is very good candidate for control of white grubs. Key words : Beauveria brongniartii ; Metarhizium anisopliae ; biological properties ; virulence ; white
表 2 三株真菌菌落在不同温度下的生长速度( SDAY) 及其孢子的萌发率
菌株
Bbr Ma1 Ma3
菌落直径日增量 ( %)
15 ℃
25 ℃
30 ℃
6107 f
14139 a 10123 c
0135 h
9159 d
6114 f
3125 g
10190 b
8115 e
开始产孢所需时间 (d)
15 ℃
25 ℃
213 不同培养基对菌落生长速度的影响 在 3 种不同培养基上常温 (25 ℃) 培养两株绿僵菌 ,在 PPDA 上的生长速度最快 ,两菌株初 始产孢日期要比在 SDAY和 Czapek 两种培养基上培养的提前 1～2d 。表明 Ma3 和 Ma1 两株真 菌在 PPDA 培养基上最适宜生长和繁殖 ,其次为 SDAY(表 3) 。
菌株名称
布氏白僵菌 绿僵菌大孢变种 绿僵菌Байду номын сангаас孢变种
菌株 代号
原寄主
Bbr 不详
Ma1 华北大黑鳃金龟 Holotrichia oblita
Ma3 金头蚤跳甲 Psylliodes chrysocephala
来源地 菌落色泽
吉林
黄白色
安徽肥西 墨绿色
英国
淡黄绿色
菌落 形态 薄粉状
绒毛状 绒毛状
基质 色泽 桔黄色
124
第 2 期 林华峰等 :布氏白僵菌和金龟子绿僵菌两变种的生长性状及其对蛴螬的毒力测定
试验设 4 个处理 ,以不用药为对照 (表 4) 。每瓶饲养一头蛴螬 ,置于养虫室内 ,保持自然温度 (5 月份 ,10～20 ℃) ,适当保湿 。每处理 30 头蛴螬 ,3 次重复 。处理后每 3d 观测一次 ,记录死 亡虫数 ,并对死虫体进行保湿培养 ( > RH90 %) ,观察其是否变为僵虫 。共观测 18d 。根据每处 理每 3d 的虫口死亡数 ,计算累计死亡率和校正累计死亡率 。 116 数据处理 以 LT50 、校正死亡率以及僵虫率作为对害虫毒力分析的指标 ,将观察时间分为 6 个间隔 相等的时间区段 ,分别统计 、整理每个时间区段内的累计死亡率 ,并校正 ,以时间 (d) 的对数值 为 X ,死亡率的几率值为 Y , 采用几率值分析法[1]计算毒力回归方程和 LT50值 。
30 ℃
712 c
311 f
514 d
910 a
411 e
812 b
912 a
314 f
618 c
孢子萌发率 ( %)
24h
48h
72h
6011 f
7213 e
8018 d
4013 g
8918 c
9213 ab
4115 g
9112 bc 9315 a
注 :表中字母相同表示 0105 水平上差异不显著 ,字母不同表示差异显著 ,下同 。
关 键 词 : 布氏白僵菌 ; 金龟子绿僵菌 ; 生物学性状 ; 致病力 ; 蛴螬 中图分类号 : S433183 ; S476112 文献标识码 : A 文章编号 : 100529261 (2006) 0220123205
Growth of Beauveria brongniartii and Two Varieties of Metarhizium anisopliae and Their Virulence against White Grubs