链霉菌总DNA提取

链霉菌总DNA提取

1. 链霉菌总DNA 提取

讲义

1。1 菌丝体

用YEME 、TSB 、TSBY 培养，蔗糖浓度：34% SCO, Slividans ，分散菌丝体; 10 % 其他菌种，有的不适于在高糖条件下生长。

是否污染：闻气味；看清汤。

1。2

NaOH 使线形DNA 变性

苯酚不能除去多糖，使上清不澄清，此时可用盐析法除多糖和蛋白质。

注意：菌丝体用量不能多。

B

CDEFGHIJ

SDS 法

SDS 量：2%SDS与溶菌酶溶液等体积。乙醇（2X ）沉淀：特异性优于异丙醇，然而体积大。-20︒C ，1 hs, 或 4︒C ，O/N，时间越长越好，可用于长距离携带。异丙醇沉淀时间：=

A 溶菌：菌丝体用量不能多！需溶菌酶，作用时间可长可短，溶菌完全即可，但不能O/N

2.9.1 链霉菌总DNA 少量快速提取

收集链霉菌菌丝体并用10.3%蔗糖洗涤1次，将100ul 菌丝体在eppendorf 离心管中用TE 洗涤1次, 于菌体沉淀块中加入500ul 溶菌酶溶液, 用自动移液器吸管头快速、强烈抽吸以悬浮和裂解细胞直到溶液变粘稠。加入50ul 20% SDS,（或100ul 10% SDS）混匀, 37℃保温10分钟后, 加入0.5倍体积的中性苯酚/氯仿, 混匀后离心, 向上清液加入0.1倍体积NaAC(pH4.8)和等体积异丙醇, 颠倒混匀, 将白色絮状沉淀挑出到70%乙醇中洗涤, 离心, DNA 沉淀块再分别用70%乙醇和无水乙醇洗涤后溶解在适量TE 缓冲液中。

2.9.2 大片段链霉菌总DNA 提取(用于构建基因文库)

适量的菌丝体(50ml液体培养物), 溶于10ml 含2mg/ml溶菌酶的LRTE 溶液(2mg/ml 溶菌酶, 25mM Tris-HCl pH8.0), 100mM EDTA (pH8.07, RNase 50ug/ml)中, 37℃溶菌至溶液清澈透亮。加入蛋白酶E 至终浓度为0.2mg/ml, 小心轻轻混匀, 30℃, 30分钟, 加入20%SDS至终浓度为1%, 立即轻轻倾斜混匀, 37℃水浴2小时。冷却至室温, 加入等体积中性苯酚, 轻轻混匀(约需10分钟), 使液体均一相形成乳浊液, 5000g 离心15分钟, 用大口径移液管转移上清液, 根据中间蛋白质的多少, 重复使用中性苯酚抽提。经中性苯酚抽提了的上清液, 再用氯仿抽提两次。最后向上清液中加入0.4倍体积的7.5M NH 4AC 和两倍体积的无水乙醇, 小心转动离心管以充分混匀, DNA立即形成白色絮状沉淀。小心挑出絮状沉淀团到5ml 70%乙醇中洗涤两次, 再用无水乙醇洗涤1次, 自然风干(勿使沉淀完全干燥, 否则极其难溶), 加入适量TE 缓冲液, 4℃过夜溶解DNA 。经脉冲电场凝胶电泳检测发现用这种方法提取的总DNA 片段在90-160kb 之间。

DNA溶液中蛋白质及RNA 的去除

一般是用Tris 饱和的苯酚或苯酚/氯仿抽提DNA 溶液以除去溶液中的蛋白质。向DNA 溶液中加入等体积的Tris 饱和的苯酚或苯酚/氯仿(pH7.8-8.0), 若DNA 分子小于10kb, 可采用剧烈振荡的方式充分混合有机相与水相, 若DNA 分子在10-30kb 之间, 可通过轻

轻摇动进行混合, 若DNA 分子大于30kb, 则需要轻轻转动和颠倒进行混合, 以免DNA 被剪切。离心分离两相, 取上层的水相(DNA分子大于30kb 时, 应使用大口径吸管), 重复

抽提数次直至有机相与水相之间看不到白色物为止。最后用等体积氯仿抽提两次以除去可能残留在溶液中的苯酚。对于DNA 样品中存留的的RNA, 可以通过加入0.1倍体积的8M LiCl, 混合后置冰浴中30分钟, 15000g 离心10分钟, 取上清液而弃去沉淀物(大分子RNA), 再向上清液中加入RNase 至终浓度为20ug/ml, 37℃, 30分钟, 即可沉淀DNA 。

有时在提取质粒和总DNA 时, 向粗提液中加入RNase 到终浓度为10ug/ml, 37℃水浴30

分钟后, 用上述方法去除蛋白质。