诱变

物理诱变剂
高能离子化辐射（X射线）
会引起目标分子失去电子，导致DNA发生广 泛的化学变异，包括断链、碱基或五碳糖的 损伤；
非离子化辐射
引起在目标分子内的分子振动，或促进电子 进入较高能级，导致形成新的化学键
紫外线—可导致相邻嘧啶碱基产生二聚体
化学诱变剂
碱基类似物
是改变碱基配对特性的正常碱基衍生物，可 诱发直接诱变
The Holliday model for homologous genetic recombination.
Helicase and nuclease activities of the RecBCD enzyme.
RecA 蛋白的作用
位点特异性重组
非同源性DNA特异片断之间的交换，由 能够识别特异DNA序列的蛋白质所介导， 并不需要RecA或单链DNA
损伤的固定
直接诱变 间接诱变
直接诱变
直接诱变起因于DNA中存在稳定的、具
有改变了的配对特性的、未修复的碱基。
正是DNA的复制使得这种非永久性损伤
固定下来，变为永久性的、可遗传的突
变
突变的固定
配 对
配 对
5-溴尿嘧啶的酮基异构体 5-溴尿嘧啶的烯醇式异构体
腺嘌呤(A) 配 对
鸟嘌呤(G)
T 配 对
C
间接诱变
一些损伤DNA聚合酶在复制时为了保证 染色体的完整性，在损伤对应的位点上 插入碱基——是对损伤的容忍，而不是转 移或修复
DNA损伤的分类
氧化性损伤——在所有需氧细胞中由于超氧化 物、氢过氧化物及羟基自由基等活性氧的存在， 会导致碱基在正常条件下发生氧化损伤；
烷基化——在烷基化试剂的作用下，将烷基加 入到碱基各位点；
shown by the dotted lines. The resulting
products are shown below
g.
Cut#1 produces products that are
recombinants (notice that the upper
molecule as the "A" allele now on the
Substitution
In the substitution mutation, one or more nucleotides are substituted by the same number of different nucleotides. In most cases, only one nucleotide is changed. Based on the change in the nucleotide type, the substitution mutation may be divided into transition and transversion mutations. Based on the consequence of mutation, the substitution mutation may be grouped into silent, missense and nonsense mutations.
DNA克隆 宿主与载体 亚克隆 DNA文库 筛选文库 克隆分析
DNA克隆
DNA克隆是指这样一种技术
将某一细胞基因组中携带有目的基因或其他 相关序列的较小片段连接到一段可以自主复 制的DNA，即载体上，形成通常可以在另一 宿主中进行复制的重组DNA，这种复制是独 立于原始基因组的。该操作过程称之为DNA 克隆
聚化加合物——相邻碱基之间的聚合或碱基与 某些外源试剂的聚合形成聚合物（如紫外线诱 导的相邻嘧啶碱之间的C5、C6环化）；
紫外诱导的DNA结构变化
DNA Repair
All Cells Have Multiple DNA Repair Systems
Direct repair----光复活 Excision repair
位 点 特 异 性 重 组
λ噬菌体整合到大肠杆菌基因组中的过程
转座作用
转座子或转座元件
是一些较短的DNA序列，可以转移进细胞基 因组的任何位置
转座作用亦称为异常重组
特点
无需序列间具有同源性 也不是位点特异的 效率极低
最简单的转座子—E.coli的IS元件或插入序列
DNA克隆简介
亚硝酸—诱导胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，从而导致 复制中发生的G.C向A.U转换；腺嘌呤脱氨变成鸟 嘌呤，使复制中发生的A.T向G.C转换；
烷化剂—甲烷磺酸甲酯、乙基亚硝基脲及芳基化 试剂
*绝大部分化学诱变剂均为致癌剂
DNA损伤
损伤是DNA正常的化学或物理结构的改变
损伤的产生：是由于碱基杂环上的N、C原子 及一些环外功能基团（酮基或氨基）的化学 活性。许多外源性物质（化学试剂）或射线 均能引起这些位点的改变，将导致碱基不能 配对或错配；
诱变
突变 复制的忠实性 物理诱变剂 化学诱变剂 直接诱变 间接诱变
突变
突变—DNA碱基序列水平上永久性的、可 遗传的改变。 产生突变的原因
DNA复制或减数分裂重组过程中的自发性错误 物理损伤 化学试剂损伤
点突变
一个单一碱基的改变
转换：嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间 颠换：嘌呤与嘧啶之间
here. The Holliday structure is now
"resolved" by cutting with endonuclease
(resolvase, the product of ruvC) and
ligation with DNA ligase. There are two
possible ways to resolve the structure,
Base-excision repair Nucleotide-excision repair
Mismatch repair
光复活
在可见光存在 下，DNA光解 酶可将环丁烷 嘧啶二聚体再 分解为单体
切除修复
碱基切除修复 核苷酸切除修复
碱基切除修复
DNA 糖基化酶识别修饰碱基 切除修饰碱基与糖基之间的N-糖苷键，留 下一个脱嘌呤或脱嘧啶位点（AP位） AP内切核酸酶在该位点切开DNA，其外切酶 活性可以继续切出一个缺口 缺口可由DNA Pol1（E.Coli）或DNA Polβ （真核生物）填补
带有重组DNA的宿主细胞的增殖构成了一群 具有遗传一致性的个体，称为单克隆
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤： １、获得待克隆的DNA片段（基因）； ２、目的基因与载体在体外连接； ３、重组DNA分子导入宿主细胞； ４、筛选、鉴定阳性重组子； ５、重组子的扩增与／或表达。
宿主和载体
常用的宿主—大肠杆菌 载体必须具备的性质
错配的碱基对由MutS和MutL蛋白复合体识别并 与之结合
该复合体随后再与MutH内切核酸酶结合，后者 在子代链GATC附近的位点上产生特异性缺刻
该缺刻启动了对含有错误碱基区域的切除修复
基因重组
同源重组 位点特异性重组 转座作用
同源重组
亦称一般重组，该过程涉及两个DNA分子间同 源区域的交换
对于双倍体真核生物而言，同源重组经常发生 在减数分裂过程中。减数分裂中期同源复制的 染色单体平行排列，非姐妹染色单体互换相对 应的区域，这样在有丝分裂结束后，产生的单 倍体配子就包含来源于父本和母本两方面的遗 传信息，可保证个体继承多方面的遗传信息
源自文库倍体细菌也可以进行重组
常发生于部分已经复制DNA之间或发生在染 色体DNA与获取的外源DNA（质粒或噬菌体） 之间
same DNA as the "c" allele). In addition,
these molecules also have heteroduplex
regions where the crossover took place.
h. Cut#2 produces molecules that are not recombinants but do have heteroduplex regions.
Deletion
Exon Skipping
内含子序列改变， 启动子结合蛋白无 法正常识别
复制的忠实性
DNA复制的错配率极低 保证DNA复制高度忠实性的机制有：
只有当进入活性位点的核苷酸与模板核苷酸 满足正确的碱基配对原则时，DNA聚合酶才 能够将其掺进来；
聚合酶的3’－5’外切酶活性可以检测出偶发 错误，并在下一个核苷酸掺入前从3’端去掉 错配的核苷酸，从而保证碱基的正确插入；
E.coli同源DNA的重组及Holliday结构
a. Two DNA molecules that are homologous in a eukaryotic cell that are about to undergo crossing over
b. An endonulcease (recBCD endonuclease in E. coli) introduces single-strand nicks into each of the strands. The arrows on the strands of each double helix are meant to indicate the 5' to 3' direction of each strand
d. The single strand nicks are now sealed by DNA ligase.
e. The cross-over point can undergo a branch migration, meaning that more of each strand becomes a part of the opposite molecule (shown here in blue and red). Notice that this results in the formation of a region that is a heteroduplex, where the two DNA strands are slightly difference. You can see the the "B" allele is not opposite the sequence for the "b" allele. Remember that alleles need only differ by one base pair.
点突变的表现型
沉默基因—点突变发生在DNA的非编码 区、非调节区或密码子的第三个碱基位 置，不会影响到掺进蛋白质的氨基酸； 错义突变—点突变改变了基因产物的一 个氨基酸；
可能是无效的，也可能是致死的 取决于被影响的氨基酸的重要性
突变类型
Substitution Deletion insertion
c. The crossing over event is a strand exchange or strand invasion. Since these are homologous chromosomes, the strands can base pair readily with each other. This strand exchange requires a protein call rec A.
f.
If this structure is rotated in three
dimensions (sometimes this is hard to
envision) it can be isomerized to give what
is called the Holliday structure shown
核苷酸切除修复
核酸内切酶在损伤部位两侧各切除精确 数目的碱基； 包含损伤的寡核苷酸被切除并留下一个 缺口； 缺口可由DNA聚合酶1填补（E.Coli）或 DNA Polδ或ε（真核生物）完成 ； 磷酸二酯键的形成由DNA连接酶完成
错配修复
是切除修复的一种特定形式，用于在复制 过程中错配并漏过校正检验的任何碱基
自身必须能够独立于宿主细胞基因组之外进 行复制与分离
应包括一个选择标记，即一个能使含有该载 体的宿主细胞区别于不含该载体的细胞，使 筛选更加便利