反义核酸与RNAi

发现过程
• RNAi现象的普遍性
随后陆续发现RNAi也存在 于水稻、烟草、果蝇、小 鼠及人等几乎所有的真核 生物中。RNAi能高效特 异的阻断基因的表达，在 线虫，果蝇体内，RNAi 能达到基因敲除的效果。
RNA干扰获得诺贝尔生理学或医学奖
2006年10月2日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会 宣布，将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予 两名美国科学安德鲁· 法尔和克雷格· 梅洛，以表 彰他们发现了RNA干扰现象。法尔和梅洛将分
化学合成
• 早期RNAi实验中，dsRNA或siRNA均由化学法所
合成。化学合成的siRNA纯度高，合成量不受限 制，且还可对siRNA进行标记，方便对其跟踪， 但该方法价格昂贵，不适用于siRNA序列的筛选 和长期基因沉默实验。
体外转录法合成siRNA
• 体外转录法合成siRNA较为经济。根据siRNA序列 合成相应DNA Oligo模板，再利用T7 RNA聚合酶进 行体外转录，分别获得siRNA的正义链和反义链， 然后将其退火、纯化即可得到能直接导入细胞的 siRNA。 • 体外转录法最大缺点是siRNA合成量受限制，不过 其价格较低，毒性小，稳定性好，效率高。

线虫体内的RNAi
• 线虫中RNAi效应的检测 • （左面）两条线虫表现为绿色荧光蛋白（GFP）表达类型品系，该品系 含有一个普遍性表达的GFP报告基因重组质粒（带有核内定位信号位点 ）。 • （右面）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体的GFP信号消 失。
发现过程
将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑 制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用 纯化后的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断
相应基因的表达。
实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后 的反义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。
Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely nonoverlapping.)
法尔和梅洛等人的研究发表以后，激发 了全球研究人员对RNA干扰领域的兴趣。 2001年和2002年，美国《科学》杂志连续 将RNA干扰列入年度十大科学进展 。
RNA干扰的分子机制
基因沉默
转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS)
基因沉默
转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)
享一千万瑞典克朗的奖金(137万美元)。
安德鲁•菲尔(AndrewZ.Fire) 克雷格•梅洛(Craig C.Mello)
麻省理工 大学 哈弗大学
目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同 的分子机制，都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶 mRNA, 抑制相应基因的表达。 实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在
他们设想将更多的色素基因注入矮脚牵牛植物 体中，试图加深花朵的紫颜色，而结果出其预料， 转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的 色素基因也受到了抑制。
加入 chalcone synthase基因
转基因
or
Fra Baidu bibliotek
发现过程
• Jorgensen 将这种现象命名为
共抑制(cosuppression)
毕业于上海第二医科大学的徐思群是那篇《自然》 论文的第二作者。自1992年起，从美国拿到硕士学位 的他在法尔实验室以研究技术员身份工作了6年。但他 扮演的角色不只是通常意义上负责实验室日常运作的 “管家”。
“一个科学实验成功的关键是实验设计和实验结果的 分析理解，这当然要归功于安迪和克雷格。我经常说 我是小人，因为小人动手，君子动口和动脑，我不过 是把他们的实验意图比较完整地在实验台上体现出来 。”徐思群说。
目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同 的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi 看作一种生物学现象，可以有以下定义：
RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA 为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异 性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入 侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发 生共同基因沉默的现象。
RNA干扰 RNA interference，RNAi
生物技术史上革命性事件
1 2 3 4
核酸结构与功能的揭示
PCR技术
重组DNA技术
RNAi和反义技术
概述
• RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化 过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高 效特异性降解的现象。
RNA干扰的发现
• 安德鲁•菲尔(AndrewZ.Fire)、克雷格•梅洛(Craig C.Mello) 1998年发现了RNA干扰和基因沉默现象 。其论文发表在1998年的NATRUE杂志上。
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-811.
线虫中观察到(RNA干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研
究生郭苏。 1995年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯(Kenneth Kemphues)指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因 时，意外地发现反义和正义这两种单链RNA都阻断了该基
因的表达。
但可惜的是，她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直
外源性:
以转基因表达的mRNA 为模板，通过异常聚合作
用形成dsRNA;
真核生物基因组中的转座子在复制表达过程 中产 生的dsRNA; RNA病毒基因组或病毒感染复制过程中产生的 dsRNA中间产物;
采 用化学合成的dsRNA;或用质粒或病毒载体表达
所需的dsRNA等
siRNA制备方法
• • • • 化学合成 体外转录法合成siRNA siRNA表达载体 siRNA表达框架
到3年后，当时在卡内基研究所供职的法尔和梅洛才揭开 了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得RNA污染了微量 的双链RNA，而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相 应基因的表达。这就是RNA干扰。
郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说：“他们在我们工
作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞 跃……我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所 贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁· 法尔和克雷格 理应获奖。”
TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉 默。
PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质 里却无相应的mRNA 存在这一现象。
RNA干扰的分子机制
1.dsRNA的产生:
内源性: 包括细胞内源性基因的双向表达; 具有反向重复序列的细胞内源性基因表达产 生的短发夹RNA (short hairpin RNA， shRN A)等
因为导入的基因和其相似的内源基因同 时都被抑制。
发现过程
• Quelling现象
并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象 。 1994年意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基 因导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中 内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌 转基因实验中这种共抑制现象被称 “quelling”（基 因压制）现象。
而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉
默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。
发现过程
• 共抑制现象的发现
RNAi研究的早期线索来自于美国和荷兰的两个
转基因植物实验组,约根森（Jorgensen）研究小组 , 在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发 现:
在实验时，要认真观察每个现象，发
现怀疑并给予证明，不要被误导。
正如美国西北大学神经生物学教授饶毅所说：“法尔的 发现打开了一个新的研究领域，它既是一项科学发现， 也是一项技术发明，为治疗人类许多疾病提供了新的希 望，这项成就和两位华人很有关系，其中一位就是法尔
实验室的研究技术员徐思群”。

发现过程

95年康乃尔大学的研究人员Guo(郭苏)和kemphues在秀 丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达，给 对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与 反义RNA 同样的结果——特异性阻断该基因的表达，这个 奇怪的现象直到3年后1998才被解开。 1998年Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显著抑制特 定基因的表达，并证明了Guo和kemphues所发现的正义 RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成 的。
• 如果将其作为一门生物技术，则定义为 ：
RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA
）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt ～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。 RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链 RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从
siRNA设计的原则
• siRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100 ～200 bp至翻译终止密码上游50～100 bp的范围内搜寻 AA序列，并记录每个AA 3 端相邻19个核苷酸作为候 选siRNA靶位点。
• 建议设计的siRNA不要针对mRNA的5 和3 端非编码区 (untranslated regions，UTRs)，因为这些区域有丰富 的调控蛋白结合位点，而UTR结合蛋白或者翻译起始 复合物可能会影响siRNP(siRNA protein complex，核 酸内切酶复合物)结合mRNA，从而影响siRNA干扰的 效果 。 • 最后还应将候选siRNA序列在GenBank进行BLAST检 索，与非同源基因具有3个或3个以上碱基相异的序列 方可选用。
Construction of siRNA by T7 RNA polymerasemediated in vitro transcription.
siRNA表达载体
• 体外合成siRNA，不宜进行长期基因沉默研究。借助 表达质粒或病毒载体在细胞内产生siRNA，使研究者 无需直接操作RNA就可达到长期抑制靶基因表达的目 的，且载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克隆 ，这将具有更为广阔的应用前景。