化学染色

方法： 1、新鲜固定30秒（4℃）水洗 2、放入基质液中30分钟37℃后， 水洗5分钟 3、置苏木紫2分钟水洗后凉干 镜检
结果： 阳性-呈棕黑色或黑色颗粒于浆内 标准：（-） 浆内无色 （+） 浆内少颗粒1/2以下 （++） 浆内散在中量颗粒1/2—3/4 （+++）有丰富颗粒3/4以上 （++++）丰富密布颗粒 全 注意：用新鲜血片为好，观察100只中性成 熟粒细胞
染色注意事项 (1) 染色涂片冲洗后，应自然干燥或风干。 (2) 染液量需充足，勿使染液蒸发干燥， 以防染料沉着于涂片上。 (3) 若细胞着色浅淡，可待标本干燥后重 染；若细胞着色太浓或沉淀物过多时， 可待标本干燥后，滴加瑞氏染液数滴 （利用其中的甲醇褪色），后冲洗、晾 干即可。
姬姆萨染色（Giemsa stain)
血液细胞化学染色 检测方法与应用
山东省立医院 . 张健
细胞化学染色概述
在组织化学的基础上发展起来的一个分 支 细胞学与化学相结合形成 保持细胞形态基础上，在细胞原位根据 化学反应的原理 研究细胞的化学成分的性质，蛋白质、 酶类、脂类、糖类、无机盐、核酸及金 属 鉴别各种类型的血液细胞，提高血液病 的诊断及鉴别诊断、疗效观察等
正常值：
钙-钴法：7——51分 （30——70） 偶氮偶联法35——70分
临床意义： 生理性： 新生儿>>婴幼儿、儿童>成人>老年人 应激状态、妊辰（分娩时高峰）增高 病理性： １ 、 感染 ： 细菌 性 感染 增 高“ 球 菌> 杆 菌”“急性>慢性” ，病毒感染无明显变 化 ２、 类白血病反应 NAP积分明显增高 ３、慢粒慢性期（无感染者）NAP积分显 著降低“0分”，CR期恢复正常，加速期 和急变期NAP积分增高。可以作为CML疗 效及预后的一种指标。
试剂： 1. Washburn氏染色液配制法 联苯胺 0.3g 95%乙醇 99ml 36%亚硝基铁氰化钠 1ml(360mg溶1ml) 棕色瓶内可保存10个月左右 2．稀双氧水（需临用前新鲜配制 需临用前新鲜配制） 需临用前新鲜配制 1%过氧化氢液 1滴 蒸馏水 5ml
操作： 1.新鲜的涂片上加上0.3%联苯胺酒精溶 液10滴染一分钟。 2.不将联苯胺液倾去，即加等量的稀双 氧水染四分钟。 3.用水冲洗，用95%的乙醇脱色。 4.用瑞氏染色液复染10-20分钟，水洗干 后镜检。
二、显色： 金属沉淀法、 偶氮偶联法、 联苯胺色素法、 Schiff反应、 普鲁士蓝反应、 脂溶染色法等等
三、复染： 显色后，为了进行对比染色方法，易观 察，进行复染 细胞核复染（苏木素、甲基绿、中性红、 沙黄、核固红） 细胞浆复染（伊红、刚果红、藻红、光 绿、坚固绿）
基本的染色方法—瑞氏染色
其他染色方法： SB ACP染色 阿利新蓝染色 胶体铁染色 phi小体染色等等
骨髓细胞检查中的临床应用
一、确定急性白血病的类型： 常用POX、SB PAS、 NAP、 ACP、 酯酶染色（…….）
二、某些血液病的鉴别诊断： 铁染色区别：缺铁性贫血OR非缺铁性贫 血； NAP鉴别：CML OR 类白反应、AA OR PNH、PV（真红）OR 继红（SE）； PAS 区 分 ： M6 OR MA 、 Gaucher’s disease OR Nieman-pick’s disease、骨 髓转移的腺癌细胞 OR 白血病细胞 ACP区分：多毛细胞与淋巴细胞、T淋巴 细胞与B淋巴细胞、Gaucher’s disease OR Nieman-pick’s disease
７、 其他：CLL、MF、ET（原发性血小 板增多）、原始神经细胞瘤、骨髓转移 癌和红血病等疾病NAP积分增高；M6、 绿色瘤、镰状细胞性贫血等疾病NAP积 分减低；恶组NAP积分减低，反应性组 织细胞增多NAP积分明显增高。 ８、 应用肾上腺糖皮质激素、雌激素、 ACTH（促肾上腺皮质激素）等NAP积分 增高。 标本新鲜（避免酶活性减低）、操作过 程中最好做一份阳性对照（AA或感染）
临床意义： 临床意义： 急粒（分化好的原始粒细胞阳性，颗粒 粗大而局灶分布；分化差可阴性） ALL（阴性；如+可能为原粒细胞） M5（阴性/弱阳性） M3（++++） M6（原粒或单，阳性或弱阳性；原、幼 红，阴性） 恶组（阴性）
碱性磷酸酶（NAP）钙-钴法 ） 钴法
与 偶氮偶联法
钴法： 钙-钴法：成熟中性粒细胞胞质内的碱性磷酸 钴法 酶碱性条件下水解B-甘油磷酸钠——磷酸钠+ 硝酸钙——磷酸钙+硝酸钴+硫化氨——硫化 钴（棕黑色）——定位于酶活性处。
氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色（AS-DCE） α- 醋酸萘酚酯酶染色（α- NAE加NaF） 醋酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS—DAE） 醋酸AS萘酚酯酶染色 α-丁酸萘酚酯酶染色 α-NBE α- 醋酸萘酚酯酶与氯化醋酸AS-D萘酚酯 酶双染色 α- 丁酸萘酚酯酶与氯化醋酸AS-D萘酚酯 酶双染色
试剂: 1.固定液-甲醇或95%乙醇 2.过碘酸溶液: 过碘酸0.5g+1/5M醋酸钠5ml+蒸馏水45ml 3.雪夫氏液:将200ml蒸馏水煮沸,缓缓加入碱性 品 红 ( 碱 性 品 红 , 指 示 剂 )1.0g, 待 冷 却 至 50οC(60οC) 时 加 入 1NHCL20ml, 待 冷 却 至 25 0c(20οC)时加入2g偏重亚硫酸钠,立即加盖使其 溶解,放暗处(冰箱)过夜,取出时呈淡黄或淡红色, 次日加活性碳1g(300mg起吸附作用),摇匀后过 滤即可，置冰箱保存 4、偏重亚硫酸钠溶液的配制（含S02的溶液）： 取10%亚硫酸氢钠5ml，加H20至100 ml（临用 前配） 5、苏木紫液
(4) 染色时间须视何种标本、涂膜厚薄， 有核细胞多少、何种细胞及室温等而定， 一般染色10~20分钟。 (5) 用自来水冲洗涂片上的染液。要轻轻 摇动涂片，使染液沉渣浮起冲走，切勿 先倾去染液再用水冲，否则，涂片上的 许多染料将沉淀于涂膜上。冲洗时间不 可过长，水冲力亦不可太大，以防脱色 或涂膜脱落。冲洗后的标本竖置在片架 上，在空气中自然干燥，或用洁净吸水 纸吸干。 (6) 镜检。
瑞氏染色（Ｗright's stain） 染色原理： 瑞氏染料中含有美蓝和伊红二种染料，前者 为碱性，后者为酸性，它们与细胞内的各种 物质具有不同的亲和力，而使其显现出不同 的色调，以便于辩认。
细胞核中的核蛋白中强碱性物质与瑞氏 染料中的酸性染料伊红有亲和力，故染 成红色；核蛋白中还有少量的弱酸性蛋 白及其氨基，它又与瑞氏染料中的美蓝 起作用，故细胞核呈紫红色 较幼稚细胞的胞浆和细胞核的核仁含有 酸性物质，与瑞氏染料中的碱性染料美 蓝有亲和力，故染成蓝色 当酸碱物质各半时，则染成红蓝色或灰 红色，即所谓嗜多色性。
三、观察疗效、估计预后： AA NAP积分增高，当病情好转OR CR时 NAP积分降低甚至正常； CML慢性期NAP显著降低OR为0分，CR 过程NAP上升甚至正常； IDA外铁消失、内铁百分率减低，当治疗 有效时增加。 慢性疾病所致贫血，患者体内单核-巨噬 细胞系统铁释放障碍、红细胞利用铁能力 降低，铁储备增加，因此外铁增多、内铁 减少。
试剂配制 瑞氏染料 1.0g 甲 醇 600ml 将瑞氏染料置于清洁的研钵内，加少量 的甲醇（也可以加入10ml甘油，充分研 磨使染料研成细粉末易溶解）充分研磨 染料，加入甲醇溶解，倒入棕色玻璃瓶 中，未溶解的染料再加少量甲醇研磨， 直到染料溶完，600ml甲醇全部用完为止。
磷酸盐缓冲液（PH6.4~6.8） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.3g 磷酸氢二钠（Na2HPO4) 0.2g 蒸馏水 加至 1000ml 配好后校正PH值，备用
糖原染色(PAS) （高碘酸 雪夫氏反应） 高碘酸--雪夫氏反应 雪夫氏反应） 糖原染色
原理： Schiff反应（细胞内含有乙二醇基的糖 类—被过碘酸氧化——双醛基+Schiff— —无色品红醛化反应——紫红色化合 物——定位糖所在，可显示糖原、粘多 糖、粘蛋白等多糖类），根据糖含量的 多少不同，呈粗细不等的红色颗粒、块 状物或均匀红色。
细胞化学染色的一般步骤
一、固定： 保持细胞的结构和成分，根据不同成分 选择适当的固定液，可使蛋白质、酶类、 脂类、糖类、无机盐、核酸及金属等成 分变成不溶性物质，在染色过程中不脱 落。 常用化学固定法，如：甲醛蒸气固定， 标本浸入甲醇、乙醇、丙酮、甲醛等固 定液，两种及以上混合液，如：10%甲 醛甲醇液，甲醛丙酮液等
结果判断： 阳性-胞浆内有兰黑色颗粒 标准：（-） 无颗粒 （+/-） 颗粒细小而分布松 （+） 颗粒粗，局灶 （++） 颗粒粗大，分布密 （+++） 颗粒粗大，成团 （++++）颗粒分布整个细胞 注意：计数100只原始细胞 （单、早幼粒不计在内）
正常细胞反应： 正常细胞反应： 粒细胞系列： 原粒（一般—，少数出现少量颗粒）， 早幼粒以下（+，越成熟越+++） EO（++++）；B（—） 单核：—/弱+，细小弥散颗粒 其他：淋巴、幼红、浆、组织细胞、巨 核、血小板（—）；巨噬细胞可+
染液主要含伊红、美蓝两种成分，染色原理与瑞氏 染色相同 2.试剂配制 姬氏染料 0.5g 甘 油 33.0ml 甲 醇 33.0ml 将染料粉未全部溶于33.0ml的甘油中，加热至 55.6～60oC，持续90～120分钟，再加入33.0ml甲 醇，摇匀后置棕色瓶中，放置数天，过滤后即可应 用
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染色方法 (1) 将标本涂膜用甲醇固定３分钟。 (2) 再置于稀释过的染液（10ml缓冲液加 1ml染液，或30滴缓冲液加染液3滴）中， 染色10～40分钟。 (3) 取出涂片，用自来水冲冼，自然干燥 即可。 (4) 镜检。
４、 急性白血病：急粒NAP积分减低、 急淋NAP积分一般增高（可以鉴别急粒 或急淋）、急单时NAP积分一般减低， 也可正常或增高。 ５、 AA时NAP积分明显增高，CR时正 常、PNH时NAP积分减低（可以与AA鉴 PNH NAP AA 别）、MDS时NAP积分减低（可以与AA 鉴别） ６、 PV（真性红细胞增多症）NAP积分 增高，继发性红细胞增多症NAP积分无 明显变化（有助于两者鉴别）
骨髓细胞检查常用的染色方法
瑞氏染色（Ｗright's stain） 姬姆萨染色（Giemsa stain) 瑞氏－姬姆萨复合染色 （Wright Geimsa mixture staing）
过氧化物酶染色（POX） 碱性磷酸酶（NAP） 钙-钴法 与 偶氮偶联法 糖原染色(PAS) 又称（过碘酸--雪夫氏反应） 铁染色(普鲁士兰)
瑞氏－姬姆萨复合染色
染色原理： 混合染色法的优点是，瑞氏染液对胞浆着色 好，姬姆萨染液则对核着色好，二法合并， 可兼得二者之优点 细胞 学检查中，常用两者进行复合染色，使 其互相补充，有利于显微镜下细胞的辨别
常用的染色方法及临床应用
一、过氧化物酶染色（POX） 过氧化物酶染色（ ） 原理： 粒细胞及部分单核细胞浆内POX酶—水解 H2O2—释放新生态氧—氧化无色联苯胺为氧 化联苯胺+亚硝基铁氰化钠—棕黑色颗粒—定 位POX酶活性所在
染色方法 ： (1) 将已编号的涂片平放于染色架上。最 好不要在涂膜两端用蜡笔划线，以免漏 掉应染之物，特别是涂片头、尾、及两 侧部。 (2) 滴加瑞氏染液。多少依标本所占面积 大小及涂片的厚薄程度而定，一般为4~8 滴，至染液将标本完全盖住为止。固定 细胞1~2分钟。 (3) 按染液：缓冲液为1：1或1：2比例， 滴加缓冲液，用吸耳球来回轻轻吹之， 使之混匀。
偶氮偶联法： 偶氮偶联法 ： 成熟中性粒细胞胞质 内的碱性磷酸酶PH9.6下——水解α磷酸萘酚钠——α-萘酚+重氮盐—偶 氮偶联形成偶氮色素沉淀—定位酶 活性所在
试剂： 1、10%固定液：甲醛10ml甲醇90ml混 合置4οc冰箱保存 2、缓冲液：0.05M2氨基-2甲基-1，3丙 二醇（2.625gH2O500ml） 3、基质液：α-磷酸萘酚钠35mg，溶于 0.05M缓冲液液35ml，再加入重氮盐固 0.05M 35ml 牢兰B或RR35mg溶解 4、苏木紫染液 5 、 可 用 0.1M 巴 比 妥 钠 9.85ml 、 0.1NHCL0.15ml 、 1%MgSO4.7H2O1ml 、 PH9.6代替丙二醇