血清学诊断技术
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接种于鸡胚尿囊腔中 3 37℃培养4-7天 4 每天照蛋2次，弃去24小时内死亡鸡胚 5 收集死胚及培养结束时的活胚
放4℃冰箱中冷却2小时以上（过夜） 6 收取尿囊液测定其HA活性（效价）
阴性者需传代2次
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血清学诊断技术
三 病毒鉴定
禽流感病毒与其他血清型的副粘病毒 以及某些细菌支原体也具有血凝性
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四 操作程序
（一）准备
试验前20分钟自4℃冰箱取出抗原; 阴、阳性血清和被检血清; 使其达到室温，并将抗原液振荡均匀
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血清学诊断技术
（二）试验过程
1. 取抗原液25ul滴于载玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被检血清 3. 快速用牙签将血清与抗原混匀 4. 并涂布成 2cm大小的片状 5. 在灯箱附近不断晃动玻片2分钟，观察 有无凝集
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四 操作程序
（一）琼脂板制备
1 琼脂粉1g 磷酸盐缓冲液100ml 2 加热煮沸， 摇动烧瓶使琼脂粉溶解 3 加入8g氯化钠振荡烧瓶，使氯化钠溶解， 4 待琼脂稍凉不烫手，倒板厚度为2.5—3mm 5 琼脂凝固后，将其倒置湿盒内，4℃保存备用
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6 新城疫病毒室温（18℃—22℃）作用 30分; 禽流
感病毒37℃作用30分.夏季结果出现快，冬季较慢
新
城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱
7 结果判定
1).完全凝集孔为终点
2).将血凝板成45°角竖立观察
3).红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集
4).孔底没有红细胞沉淀,红细胞均匀平铺于孔底为凝
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三 器材 1.血凝板、 2.微量移液器 3.标准抗原 4.1%红细胞悬浮液 5.被检血清 6.稀释液
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四 操作程序 （一）0.5％――１％红细胞的准备
1.阿氏液(抗凝剂)的配制
葡萄糖
1.866ｇ
柠檬酸钠 0.8ｇ
柠檬酸
0.055ｇ
氯化钠 0.418g
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二 适用范围
( 琼脂扩散试验适用)
禽流感、 传染性支气管炎 传染性法氏囊病、 传染性喉气管炎 鸡痘、 马立克氏病、 传染性脑脊髓炎 网状内皮组织增生症、 病毒性关节炎 多杀性巴氏杆菌病的抗体检测。
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三 器材
琼脂扩散板（平皿）;打孔器、 移液器;0.01M PH 7.2 的 磷酸缓冲液;琼脂粉（糖）
-
+
++ +
+
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血清学诊断技术
注意 能使鸡红细胞完 全凝集的病毒 液的最高稀释 倍数，称为该 病毒液的红细 胞凝集效价。 如上例，病毒 病的HA效价为 1：320。
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（四) 红细胞凝集抑制试验
1. 抗原准备（工作浓度的准备 ）
红细胞凝集抑制试验（HI试验）时，病毒抗原液 25ul内需含4个凝集单位，所以，应将原菌抗原毒作 成320/4=80倍稀释。
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五 结果判定
2 分钟内出现明显凝集（背景透亮）为阳性;背景均 匀一致呈混浊样，无凝集者为阴性.
鸡白痢沙门氏菌
阴
的平板凝集试验
性
的观察
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阳 性
血清学诊断技术
新城疫病毒、 禽流感病毒的分离和鉴定
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一 病料的采集和处理
活动物： 气管、喉头、呼吸道分泌物（拭子）
的平均值表示的。 (3).检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，。 (4).大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于
0.1%-0.5%，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为 理想的抽样率应为2%。 (5）.鸡群接种新城疫疫苗后，经2-3周测血清中的HI抗体效 价若提高2个滴度以上，表示免疫应答良好，疫苗接种 成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。
(1)抗原 一般以鸡新城疫II系或Lasota系作为已知抗原。 来源: 1).购买: 目前也有用聚乙二醇使Lasota系病毒液浓缩，作
成稳定浓缩抗原，HA效价达1：5000以上，4℃半年 不变。
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2) 自制: A. 用鸡新城疫II系或者Lasota系疫苗接种鸡胚制备抗原： B. 疫苗用灭菌生理盐水稀释10倍，以0.1毫升接种于10日 龄的鸡胚尿囊内; C. 凡接种后72-120小时内死亡的鸡胚，且病变显著者， 分别收获鸡胚尿囊液于消毒试管内，如有血细胞应离心 （2000转/分钟）15分钟，取上清液; D. 作HA试验，其凝集价在1：640以上的鸡胚鸡，分装于
最小致死量为引起所有鸡胚死亡最大稀释度
MDT最小致死量引起鸡胚死亡平均时间 强 毒—60小时 中等毒力—61-90小时 低等毒力—90小时
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（二） 脑内致病指数（IICP）
1、取凝集价在24以上的新鲜感染尿囊液 水10倍稀释；
用生理盐
2、脑内接种1日龄雏鸡（24-40小时） 每只0.05ml；
将血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心 5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白 细胞薄膜，将沉淀的细胞加稀释液（生理盐水）洗 涤，再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟，充 去上清液，再加稀释液洗涤，
如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细 胞，按1%的稀释度加入稀释液（1毫升红细胞泥 加99毫升稀释液）。
完全抑制孔红细胞呈泪滴样下沉,此孔为抑制终点.
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孔号
稀释倍数
生理盐水 待检血清
鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（HＩ试验） (过程图)
1
2
3
4
5
6
7
8
１
２
３
４
５
６
７
８
２５
25
25
25
25
25
25
25
２５
25
25
25
25
25
25
25
单位：μl
9
10
９
对照
25
25
25 (25)弃去
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2020/12/5
血清学诊断技术
红细胞凝集抑制试验
一原 理 许多病毒具有凝集动物红细胞的能力, 这种凝集能力
可被相应的抗体所抑制, 故可用已知病毒检测相应的血凝 抑制抗体 .
也可以用已知标准抗体对分离的病毒进行鉴定.
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二 使用范围
新城疫、 禽流感、 减蛋综合征、 鸡毒支原体、 滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病 原分离后的鉴定
25
25 (25)弃去
生理盐水（毫升） 25
25
25
25 25 25 25
25
25
25
0.5%红细胞液
25
25
25
25 25 25
25
25
25
25
（毫升）
作用温度与时间
混合均匀置18~22℃作用45~60分钟，对照管出现结果时判定
结果（举例） ++++ +++ ++ +++ ++++ +++ ++++ ++ -
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(二)．被检血清
将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注 入洁净干燥试管内（微量法可用孔经2-3毫米塑料管由翅 静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。
注意: 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。
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(三） 血凝抗原效价测定 （操作量25ul）
10只，
3、 每24小时观察一次，共观察8天；
蒸馏水 100ml
混匀放入100 ml葡萄糖瓶内，10磅115度10分钟 高压灭菌。冷却后4℃保存备用。
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2.采血 取健康鸡翅静脉或心脏采血，(按阿氏液2份，血液1
份） 注意:(1). 两只健康的鸡血混合;
(2). 阿氏液的量要够
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3. 红细胞悬液的配制：
洁净干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱备用。
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2.抗原血凝价的测定 每种抗原做两排，结果取均值
1). 1-12孔加生理盐水25ul 2). 第1孔加抗原25ul，反复吹打10次吸取25ul到第2孔， 依此类推倍比稀释至第11孔 3). 最后从第11孔吸取25ul弃去,第12孔做生理盐水对照 4). 所有孔加25ul 1％红细胞 5). 将血凝板振荡1分钟
4单位抗原
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
放室温作用１５－－２０分钟
0.5%红细胞 25
25
25
25ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
25
25
25
25
25
25
液（毫升）
作用温度与 时间
混合均匀置18-22℃作用45-60分钟，对照管出现结果时判定
结果
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3.结果报告 (1).鸡的免疫临界水平。 (2).鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价（log2）
常用已知细菌性抗原检测相应的凝集抗体
凝集试验包括：试管凝集反应 、平板凝集反应全 血平板凝集反应、血清平板凝集反应）.
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二 适用范围
鸡白痢、鸡伤寒 鸡毒支原体、滑液囊支原体 鸡副嗜血杆菌病（鸡传染性鼻炎）
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三 器材
凝集抗原、阳性、阴性血清 被检血清，移液器（5—50ul） 载玻片，25℃灯箱
（二） 打孔
1 用打孔器按7孔梅花图案打孔 孔径为3mm-4mm,孔距为3mm 大平皿可打六组梅花孔
2 打孔后用7#针头挑出孔内琼脂
3 最后在酒精灯上烧烤封底
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（三） 加样
1 中间孔加抗原 2 外周孔加血清 1、4 孔加阳性血清; 其他
孔加待检血清; 加样至满孔为止; 3 室温下放置10—20分钟
清孔沉淀线直向被检血清孔则被检血清判为阴性
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血清平板凝集试验
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一 原理
细菌性颗粒抗原与相应的抗体结合,在适当的电解 质参与下, 经过一段时间抗原颗粒相互凝集成肉眼可 见团快.
可用相应特异阳性血清进行血凝抑制试验 或全血平板凝集抑制试验进行鉴定
新城疫→血凝抑制试验→禽流感→ 琼脂扩散试验→不同血清型禽流感血凝抑制试验
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四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力测定
（一） 鸡胚平均致死时间（MDT）（最小致死量）
1 将新鲜感染尿囊液进行101--109稀释 2 每个稀释度接种5枚9—11天 SPF鸡0.1ml/胚 3 置37℃培养。每日照蛋2次 4 连续观察7天，记录每个鸡胚死亡时间
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2 操作步骤 (1) 每孔加25ul的稀释液: (2) 第1孔加25ul待检血清，反复吸吹10次; 吸取25ul于第 (3) 2孔，以此类推倍比稀释至第11孔; 最后从第11孔取2 (4) 5ul弃去,第12孔为抗原对照; (3) 每孔加4单位抗原;室温下( 18-22℃)作用30分 (4) 取1％红细胞25ul加于各孔中 (5) 将血凝板振荡1分钟 (6) 室温作用30-45分钟（禽流感 37℃）观察结果 (7) 结果判定 将血凝板呈45°竖起观察
死动物 ： 肝、脾、肺等内脏用生理盐水（肉汤） （含双抗2000单位/ml） 制成1０－2０％组织匀浆 4℃冰箱作用２－４小时或过夜 １０００转／分 离心１０分钟 取上清液备用
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二 鸡胚接种
1 取9-11日龄SPF鸡胚，每个样接种5-10个鸡胚 2 取上述处理的上清液0.2ml
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琼脂免疫扩散试验（AGP）
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一 原理
抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中,可以向四 周扩散,当抗原抗体扩散到适当比列处相结合,出现 肉眼可见的沉淀线.
常用已知抗原检测相应的抗体
集,此孔稀释倍数为1个工作单位
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鸡新城疫红细胞凝集试验（HA试验） (过程图)
孔号
1
稀释倍数
5
生理盐水（毫升） 4*
病毒液（毫升）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10
20
40 80 160 320 640 1280
对照
25
25
25 25 25 25
25
25
25
25
25
25 25 25 25
使孔内液体扩散完毕或液面下降 4 将琼脂板倒置于湿盒内
37℃温箱内作用24-72小时观察结果
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五 结果判定
（一） 当阳性血清与抗原孔之间出现清晰沉淀线
证
明实验成立
（二） 如果被检血清与抗原孔之间出现沉淀线 或阳
性血清的沉淀线向邻近被检血清孔内侧偏弯者，被检血清判为
阳性
（三） 如果被检血清孔与抗原孔之间没有沉淀线;而且阳性血
放4℃冰箱中冷却2小时以上（过夜） 6 收取尿囊液测定其HA活性（效价）
阴性者需传代2次
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三 病毒鉴定
禽流感病毒与其他血清型的副粘病毒 以及某些细菌支原体也具有血凝性
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四 操作程序
（一）准备
试验前20分钟自4℃冰箱取出抗原; 阴、阳性血清和被检血清; 使其达到室温，并将抗原液振荡均匀
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（二）试验过程
1. 取抗原液25ul滴于载玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被检血清 3. 快速用牙签将血清与抗原混匀 4. 并涂布成 2cm大小的片状 5. 在灯箱附近不断晃动玻片2分钟，观察 有无凝集
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四 操作程序
（一）琼脂板制备
1 琼脂粉1g 磷酸盐缓冲液100ml 2 加热煮沸， 摇动烧瓶使琼脂粉溶解 3 加入8g氯化钠振荡烧瓶，使氯化钠溶解， 4 待琼脂稍凉不烫手，倒板厚度为2.5—3mm 5 琼脂凝固后，将其倒置湿盒内，4℃保存备用
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6 新城疫病毒室温（18℃—22℃）作用 30分; 禽流
感病毒37℃作用30分.夏季结果出现快，冬季较慢
新
城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱
7 结果判定
1).完全凝集孔为终点
2).将血凝板成45°角竖立观察
3).红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集
4).孔底没有红细胞沉淀,红细胞均匀平铺于孔底为凝
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三 器材 1.血凝板、 2.微量移液器 3.标准抗原 4.1%红细胞悬浮液 5.被检血清 6.稀释液
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四 操作程序 （一）0.5％――１％红细胞的准备
1.阿氏液(抗凝剂)的配制
葡萄糖
1.866ｇ
柠檬酸钠 0.8ｇ
柠檬酸
0.055ｇ
氯化钠 0.418g
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二 适用范围
( 琼脂扩散试验适用)
禽流感、 传染性支气管炎 传染性法氏囊病、 传染性喉气管炎 鸡痘、 马立克氏病、 传染性脑脊髓炎 网状内皮组织增生症、 病毒性关节炎 多杀性巴氏杆菌病的抗体检测。
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三 器材
琼脂扩散板（平皿）;打孔器、 移液器;0.01M PH 7.2 的 磷酸缓冲液;琼脂粉（糖）
-
+
++ +
+
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血清学诊断技术
注意 能使鸡红细胞完 全凝集的病毒 液的最高稀释 倍数，称为该 病毒液的红细 胞凝集效价。 如上例，病毒 病的HA效价为 1：320。
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（四) 红细胞凝集抑制试验
1. 抗原准备（工作浓度的准备 ）
红细胞凝集抑制试验（HI试验）时，病毒抗原液 25ul内需含4个凝集单位，所以，应将原菌抗原毒作 成320/4=80倍稀释。
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血清学诊断技术
五 结果判定
2 分钟内出现明显凝集（背景透亮）为阳性;背景均 匀一致呈混浊样，无凝集者为阴性.
鸡白痢沙门氏菌
阴
的平板凝集试验
性
的观察
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阳 性
血清学诊断技术
新城疫病毒、 禽流感病毒的分离和鉴定
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血清学诊断技术
一 病料的采集和处理
活动物： 气管、喉头、呼吸道分泌物（拭子）
的平均值表示的。 (3).检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，。 (4).大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于
0.1%-0.5%，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为 理想的抽样率应为2%。 (5）.鸡群接种新城疫疫苗后，经2-3周测血清中的HI抗体效 价若提高2个滴度以上，表示免疫应答良好，疫苗接种 成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。
(1)抗原 一般以鸡新城疫II系或Lasota系作为已知抗原。 来源: 1).购买: 目前也有用聚乙二醇使Lasota系病毒液浓缩，作
成稳定浓缩抗原，HA效价达1：5000以上，4℃半年 不变。
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2) 自制: A. 用鸡新城疫II系或者Lasota系疫苗接种鸡胚制备抗原： B. 疫苗用灭菌生理盐水稀释10倍，以0.1毫升接种于10日 龄的鸡胚尿囊内; C. 凡接种后72-120小时内死亡的鸡胚，且病变显著者， 分别收获鸡胚尿囊液于消毒试管内，如有血细胞应离心 （2000转/分钟）15分钟，取上清液; D. 作HA试验，其凝集价在1：640以上的鸡胚鸡，分装于
最小致死量为引起所有鸡胚死亡最大稀释度
MDT最小致死量引起鸡胚死亡平均时间 强 毒—60小时 中等毒力—61-90小时 低等毒力—90小时
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（二） 脑内致病指数（IICP）
1、取凝集价在24以上的新鲜感染尿囊液 水10倍稀释；
用生理盐
2、脑内接种1日龄雏鸡（24-40小时） 每只0.05ml；
将血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心 5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白 细胞薄膜，将沉淀的细胞加稀释液（生理盐水）洗 涤，再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟，充 去上清液，再加稀释液洗涤，
如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细 胞，按1%的稀释度加入稀释液（1毫升红细胞泥 加99毫升稀释液）。
完全抑制孔红细胞呈泪滴样下沉,此孔为抑制终点.
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孔号
稀释倍数
生理盐水 待检血清
鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（HＩ试验） (过程图)
1
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8
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６
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８
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25
25
25
25
25
25
25
２５
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25
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单位：μl
9
10
９
对照
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25 (25)弃去
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红细胞凝集抑制试验
一原 理 许多病毒具有凝集动物红细胞的能力, 这种凝集能力
可被相应的抗体所抑制, 故可用已知病毒检测相应的血凝 抑制抗体 .
也可以用已知标准抗体对分离的病毒进行鉴定.
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二 使用范围
新城疫、 禽流感、 减蛋综合征、 鸡毒支原体、 滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病 原分离后的鉴定
25
25 (25)弃去
生理盐水（毫升） 25
25
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25 25 25 25
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0.5%红细胞液
25
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25
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（毫升）
作用温度与时间
混合均匀置18~22℃作用45~60分钟，对照管出现结果时判定
结果（举例） ++++ +++ ++ +++ ++++ +++ ++++ ++ -
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血清学诊断技术
(二)．被检血清
将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注 入洁净干燥试管内（微量法可用孔经2-3毫米塑料管由翅 静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。
注意: 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。
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(三） 血凝抗原效价测定 （操作量25ul）
10只，
3、 每24小时观察一次，共观察8天；
蒸馏水 100ml
混匀放入100 ml葡萄糖瓶内，10磅115度10分钟 高压灭菌。冷却后4℃保存备用。
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2.采血 取健康鸡翅静脉或心脏采血，(按阿氏液2份，血液1
份） 注意:(1). 两只健康的鸡血混合;
(2). 阿氏液的量要够
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3. 红细胞悬液的配制：
洁净干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱备用。
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2.抗原血凝价的测定 每种抗原做两排，结果取均值
1). 1-12孔加生理盐水25ul 2). 第1孔加抗原25ul，反复吹打10次吸取25ul到第2孔， 依此类推倍比稀释至第11孔 3). 最后从第11孔吸取25ul弃去,第12孔做生理盐水对照 4). 所有孔加25ul 1％红细胞 5). 将血凝板振荡1分钟
4单位抗原
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放室温作用１５－－２０分钟
0.5%红细胞 25
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25ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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液（毫升）
作用温度与 时间
混合均匀置18-22℃作用45-60分钟，对照管出现结果时判定
结果
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血清学诊断技术
3.结果报告 (1).鸡的免疫临界水平。 (2).鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价（log2）
常用已知细菌性抗原检测相应的凝集抗体
凝集试验包括：试管凝集反应 、平板凝集反应全 血平板凝集反应、血清平板凝集反应）.
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血清学诊断技术
二 适用范围
鸡白痢、鸡伤寒 鸡毒支原体、滑液囊支原体 鸡副嗜血杆菌病（鸡传染性鼻炎）
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三 器材
凝集抗原、阳性、阴性血清 被检血清，移液器（5—50ul） 载玻片，25℃灯箱
（二） 打孔
1 用打孔器按7孔梅花图案打孔 孔径为3mm-4mm,孔距为3mm 大平皿可打六组梅花孔
2 打孔后用7#针头挑出孔内琼脂
3 最后在酒精灯上烧烤封底
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（三） 加样
1 中间孔加抗原 2 外周孔加血清 1、4 孔加阳性血清; 其他
孔加待检血清; 加样至满孔为止; 3 室温下放置10—20分钟
清孔沉淀线直向被检血清孔则被检血清判为阴性
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血清平板凝集试验
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一 原理
细菌性颗粒抗原与相应的抗体结合,在适当的电解 质参与下, 经过一段时间抗原颗粒相互凝集成肉眼可 见团快.
可用相应特异阳性血清进行血凝抑制试验 或全血平板凝集抑制试验进行鉴定
新城疫→血凝抑制试验→禽流感→ 琼脂扩散试验→不同血清型禽流感血凝抑制试验
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四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力测定
（一） 鸡胚平均致死时间（MDT）（最小致死量）
1 将新鲜感染尿囊液进行101--109稀释 2 每个稀释度接种5枚9—11天 SPF鸡0.1ml/胚 3 置37℃培养。每日照蛋2次 4 连续观察7天，记录每个鸡胚死亡时间
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2 操作步骤 (1) 每孔加25ul的稀释液: (2) 第1孔加25ul待检血清，反复吸吹10次; 吸取25ul于第 (3) 2孔，以此类推倍比稀释至第11孔; 最后从第11孔取2 (4) 5ul弃去,第12孔为抗原对照; (3) 每孔加4单位抗原;室温下( 18-22℃)作用30分 (4) 取1％红细胞25ul加于各孔中 (5) 将血凝板振荡1分钟 (6) 室温作用30-45分钟（禽流感 37℃）观察结果 (7) 结果判定 将血凝板呈45°竖起观察
死动物 ： 肝、脾、肺等内脏用生理盐水（肉汤） （含双抗2000单位/ml） 制成1０－2０％组织匀浆 4℃冰箱作用２－４小时或过夜 １０００转／分 离心１０分钟 取上清液备用
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二 鸡胚接种
1 取9-11日龄SPF鸡胚，每个样接种5-10个鸡胚 2 取上述处理的上清液0.2ml
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琼脂免疫扩散试验（AGP）
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一 原理
抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中,可以向四 周扩散,当抗原抗体扩散到适当比列处相结合,出现 肉眼可见的沉淀线.
常用已知抗原检测相应的抗体
集,此孔稀释倍数为1个工作单位
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鸡新城疫红细胞凝集试验（HA试验） (过程图)
孔号
1
稀释倍数
5
生理盐水（毫升） 4*
病毒液（毫升）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10
20
40 80 160 320 640 1280
对照
25
25
25 25 25 25
25
25
25
25
25
25 25 25 25
使孔内液体扩散完毕或液面下降 4 将琼脂板倒置于湿盒内
37℃温箱内作用24-72小时观察结果
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五 结果判定
（一） 当阳性血清与抗原孔之间出现清晰沉淀线
证
明实验成立
（二） 如果被检血清与抗原孔之间出现沉淀线 或阳
性血清的沉淀线向邻近被检血清孔内侧偏弯者，被检血清判为
阳性
（三） 如果被检血清孔与抗原孔之间没有沉淀线;而且阳性血