金色链霉菌接合转移体系的构建_方志锴

摘要： 以金色链霉菌 J13 基因组 DNA 为模板， 扩增金霉素 C6 甲基化酶基因 ctcF 上下游序列作为两端同源交换臂， 在两臂
* 并在该基因上游加入组成型强启动子 ermE ， 以强化筛选标记． 将该外源 DNA 序列插入 之间添加抗性筛选标记 neo 基因， MS 平板上筛选阳 到质粒 pSET152 ， 构建重组质粒 pFD106． 转化大肠杆菌 ET12567 后， 经接合转移导入金色链霉菌 J13 中，
获得特定代谢产物． 国内外对金色链霉菌进行分子操作的报道 ， 多建立在制备原生质体的基础上， 步骤繁 ［4 ］ 琐、 操作复杂 ． 而接合转移可在一定程度上绕过宿主的限制性障碍 ， 且操作简单、 宿主范围广， 目前已成 功应用于多种链霉菌
［5 ， 6 ］
．
［7 ］ 本研究以整合型质粒载体 pSET152 为基础， 构建了重组质粒 pFD106 ， 并通过接合转移整合到染色 体中， 为金色链霉菌的基因操作创造了条件 ， 为最终获得去甲基金霉素工程菌奠定基础 ．
－1 LB 培养基中抗生素终浓度： 氨苄青霉素 100 μg · mL － 1 ， 安普霉素 50 μg · mL ， 氯霉素 25 μg · －1 －1 －1 mL ， 卡那霉素 25 μg·mL ； 接合转移培养基中抗生素终浓度： 安普霉素 25 μg · mL ， 卡那霉素素 25 －1 －1 μg·mL ， 萘啶酸 20 μg·mL ． 1 ． 2 方法
1．2．1 1．2．2
融化已灭菌的培养基， 当温度降到约 45 ℃ 时分别加入适当梯度的抗生素． 凝 35 ℃ 培养 5 d， 固后涂布金色链霉菌单孢子菌悬液 ， 以生长情况来确定金色链霉菌对抗生素的敏感性 ． 抗生素敏感性实验
JH2 ， JH3 、 JH4 ； 引物设计 根据推测的 C6 甲基化酶基因 ctcF 两端序列设计两端交换臂引物： JH1 、 N2． 为方便基因克隆， 以质粒 supercos1 上的卡那霉素抗性基因 neo 为模板， 设计引物 N1 、 引物上分别引入 JH1 ： 5'-GGATCC GCGGAGCTCGATATCAGTACGACCTTCGGT3' （ BamHI， EcoRV ） ； JH2 ： 5'-CTCGAG GGTACCAATGATCTCGCCGTTGTCCGTCATG3' （ Xho Ⅰ， Kpn ） ； JH3： 5'ATA CTCGAG AGCGTGGTGCCCGAAⅠ
－1
金色链霉菌对不同抗生素的敏感性
质量浓度 / （ μg·mL － 1 ） 0 ++ ++ ++ 12．5 + + － 25 － + －
1）
The antibiotic sensitivity of S． aureofaciens
50 － － －
++ ． 正常生长； + ． 少量生长； –． 无法生长．
［9 ］ 大肠杆菌感受态的制备和转化采用 CaCl2 法 ． 重组质粒需在 pUZ8002 ［8 ］ 的协助下， 通过接合转移 从大肠杆菌 ET12567 导入金色链霉菌中． 接合子的初筛利用抗性筛选和孢子 ［10 ］ ［8 ］ PCR ， 复筛需提取染色体 DNA 进行 PCR．
2
2． 1
wk.baidu.com结果与讨论
相应的酶切位点：
） ； JH4： 5'-GATATC GTCGACAGATCTAACGCGACCTCCCGTCTCG3' （ EcoRV， Bgl Ⅱ） ； N1： 5'GAT 3' （ XhoⅠ GGTACC ACGTAGAAAGCCAGTCCG3' （ Kpn ） ； N2： 5'GCA CTCGAG AGAACTCCAGCATGAGATC3' （ Xho ）． Ⅰ Ⅰ 1．2．3 金色链霉菌的接合转移
性接合子． PCR 检测表明， 重组质粒已整合到染色体 DNA 上． 关键词： 金色链霉菌； 去甲基金霉素； 接合转移 5470 （ 2011 ） 05052104 中图分类号： Q784 文献标识码： A 文章编号： 1671-
Construction of the conjugal transfer system of Streptomyces aureofaciens
JH1 与 JH2 、 JH3 与 JH4 为引物， 以金色链霉菌染色体 DNA 为模板， 分别进行 PCR， 扩增得到两端同源 1 和 ctcF2． 以质粒 surpercos1 为模板、 N1 与 N2 为引物， 1 扩增抗性筛选基因 neo （ 图 1 ） ． ctcF交换臂 ctcF2 分别经 pMD19T 克隆得到阳性克隆子， Xho Ⅰ 和 ctcF依次命名为 pFD101 与 pFD102． pFD101 经 BamHI酶切， 回收 1934 bp 片段， 与经同样双酶切的 pFD102 片段（ 4553 bp） 进行酶连并转化， 得到阳性转化子， 命 HindⅢ酶切， 1、 ctcF2 ） 和 4015 bp 名为 pFD103． pFD103 和 pBR322 分别经 BamHI依次回收 3831 （ 含 ctcF片段， 经连接和克隆等操作， 得到阳性克隆子， 命名为 pFD104． 回收 Kpn Ⅰ / Xho Ⅰ 酶切过的 pFD104 片段 （ 7836 bp） 和 KpnⅠ / XhoⅠ酶切过的 neo（ 1267 bp） 与 pBSVII41F 经 KpnⅠ 切下的 469 bp 片段 （ 含红霉素
福建农林大学学报（ 自然科学版） Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （ Natural Science Edition）
第 40 卷 第 5 期 2011 年 9 月
金色链霉菌接合转移体系的构建
1 1 1 1 2 方志锴 ，洪文荣 ，严凌斌 ，潘成奇 ，朱宝泉 （ 1． 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350108 ； 2． 上海医药工业研究院， 上海 200040 ）
* 启动子 ermE ） ， 经酶连转化等操作得到阳性转化子 ， 命名为 pFD105． pFD105 经 EcoRV 酶切， 回收 5514 bp
片段， 与同样经 EcoRV 酶切后的 pSET152 相连， 经转化等操作得到阳性克隆子， 命名为 pFD106 ， 其图谱见 图 2． pFD106 的酶切鉴定如图 3 所示， 该质粒经 Bgl Ⅱ 酶切， 得到 8379 与 2850 bp 的带； 经 Xho Ⅰ 与 Kpn Ⅰ
FANG Zhikai1 ，HONG Wenrong1 ，YAN Lingbin1 ，PAN Chengqi1 ，ZHU Baoquan2
（ 1． College of Biological Science and Technology，Fuzhou University，Fuzhou，Fujian 350108 ，China； 2． Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200040 ，China） Abstract： Two exchange arms，which were respectively located upstream and downstream of gene ctcF encoding methylase of the C6 position of chlortetracycline，were amplified by PCR from Streptomyces aureofaciens J13 genomic DNA． The marker gene neo and constitutive promoter ermE * were then inserted between the arms． With these fragments，we constructed pSET152derived vector pNEO152． The recombinant vector was transformed to Escherichia coli ET12567 （ pUZ8002 ） ，and then transfered to S． aureofaciens J13 by conjugation． The positive transformants were selected on MS plate． After PCR identification，it was confirmed that pFD106 was integrated into the chromosome． Key words： Streptomyces aureofaciens； demeclocycline； conjugation
1
1． 1
材料与方法
材料
1．1．1
菌株与质粒 大肠杆菌 Top10 为基因克隆受体菌， 大肠杆菌 ET12567 （ pUZ8002 ） 为接合转移供体 菌， 金色链霉 菌 （ Streptomyces aureofaciens ） J13 为 接 合 转 移 受 体 菌， 以 上 菌 株 均 由 本 实 验 室 保 存． 质 粒
· 522· 1．1．2
福建农林大学学报（ 自然科学版）
第 40 卷
Taq 酶和 DNA Marker 等均购自 TaKaRa 公司； 限制性内切酶和试剂 限制性核酸内切酶、 连接酶、 DNA 回收试剂盒购自生工生物工程（ 上海） 有限公司； 其他常规试剂参见文献［ 8］ ． 1．1．3 培养基和抗生素 金色链霉菌固体培养基为 （ NH4 ） 2 HPO4 0． 03% 、 KH2 PO4 0． 01% 、 MgSO4 ·6H2 O MS 固体 0．02% 、 麸皮 5．0% 和琼脂 2． 0% ． 细菌培养基为 LB 液体培养基， 接合转移使用的预萌发培养基、 8］ ． 培养基和 TSB 固体培养基参见文献［
金色链霉菌对抗生素的敏感性试验
表1
Table 1 抗生素 卡那霉素 大观霉素 安普霉素
1）
为确定接合转移系统的筛选标记以选择合适的 载体， 考察了金色链霉菌对链霉菌筛选常用的 3 种 氨基糖苷类抗生素的敏感性（ 表 1 ） ． 从表 1 可见， 金 色链霉菌对所试抗生素均敏感， 其中卡那霉素对其 最小抑制浓度为 25 μg · mL ， 安普霉素的最小抑 －1 制浓度为 12． 5 μg · mL ． 故本研究确定以卡那霉 素抗 性 基 因 neo 为 筛 选 标 记． 该 结 果 也 证 明 了 pSET152 载体上安普霉素抗性基因 aac（ 3 ） Ⅳ的可用性． 2．2 接合转移质粒 pNEO152 的构建
［1 ， 2 ］ ．该 去甲基金霉素属四环类抗生素， 具广谱抗菌活性， 是合成米诺环素和替加霉素的重要中间体 仅在 C6 上少一甲基． 因此， 若能阻断金色链霉菌中金霉素生物合成基因簇上的 抗生素与金霉素结构相似，
C6 甲基化酶基因， 就有望获得去甲基金霉素工程菌 ． 制
［3 ］
传统上多利用物理和化学因子对金色链霉菌进行诱变 ， 但因效果不佳、 无法定向改造而受到很大限 ． 随着分子生物学的发展， 目前可利用基因工程方法对不同微生物的相关基因和代谢途径进行操作 ，
pBR322 、 surpercos1 及整合型质粒 pSET152 由本实验室保存． 质粒 pBSVII41F （ 含红霉素启动子 ermE * ） 由上海医药工业研究院邵雷博士惠赠 ．
收稿日期： 2010 － 12 － 13 修回日期： 2011 － 01 － 20 基金项目： 国家自然科学基金资助项目（ 31070093 /30801449 ） ； 福建省教育厅资助项目（ 2007F5070 ） ． 作者简介： 方志锴（ 1986 － ） ， 男， 硕士研究生． 研究方向： 生物化学和分子生物学． Email： fangzk1986@ qq． com． 通讯作者洪文荣（ 1956 － ） ， 男， 教授， 博士． 研究方向： 微生物制药． Email： hongwr56@ 163． com．