荧光偏振分析方法-PPT医学课件

MAP探针 (Mass Amplifying Probe)
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
核酸检测
蛋白质增强荧光偏振
Anal. Chem. 1995, 67, 3945-3951.
如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性； 如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发
光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。
Polarized excitation
100% 0%
<100% >0%
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振 分析方法
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
非偏振光原理图
光的偏振性
自然光在各个方向 振动是均匀分布的
偏振光原理图
一束光线都在同一 方向上振动
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振
（Fluorescence Polarization，FP）
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
非竞争法检测小分子化合物
空间构象变化
Anal. Chem. 2009, 81, 7468-7473.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台
Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 3229-3234.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
多元检测方法
5. 小分子分析
Chem. Commun. 2012, 48, 10004–10006.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案
P 11 3(P 10 1 3)1(V RT )
Nucleic Acids Res. 2003, 31: e70.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
实时监测蛋白酶催化过程
• 蛋白酶对机体的新陈代谢 和生物调控起到非常重要 的作用；
• 蛋白酶酶活的评估有助于 理解特定的生化途径、开 发治疗药物。
Chem. Rev. 2010, 110, 2685-2708.
荧光偏振免疫分析原理
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
近年来，FPIA备受生物、化学、医学专家们的亲睐，有关FPIA在临床化 学、农药残留分析、食品安全、环境监测中应用的报道逐年增加，成为生化分 析和环境监测中强有力的工具。
优点：均相分析无需分离、迅速、灵敏、无放射性污染、重现性高；
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§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
超灵敏检测DNA
3. 核酸分析
改进传统的荧光偏振检测方 法，通过引入酶促反应扩增检测 信号应用于超灵敏检测特异性 DNA的检测。
Chem. Commun. 2011, 47, 3478-3480.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
3. 核酸分析
实时监测DNA双链的形成和解链过程
如何衡量：偏振值的定义
P= +
r=
-
+2
偏振值一般以mP（毫偏）来表示
对于完全偏振发射，P = r = 1；对于自然光，P = r = 0
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
偏振值的影响参数
分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过 68.5度角时所用的时间；
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振分析的一般步骤
• 利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前 后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。
• 如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振 光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位 mP）。
缺点：FPIA不如酶联免疫吸附测定(ELISA)灵敏，且荧光标记物可能会与样 本中的基质特异性结合，使荧光偏振值增加，产生一定干扰。
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
蛋白质与核酸的相互作用是许多生命活动的重要部分，因此成为分子生物 学研究的一个热点
荧光偏振技术为研究蛋白质-核酸 相互作用提供了一个免分离、免 放射性的途径
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 常用的测试仪器及配件
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 国内外研究现状及发展动态分析
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。
分子旋转弛豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常 数有关。
P 11 3(P 10 1 3)1(V RT )
偏振值衡量荧光分子的运动性
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化 分析领域。
20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在 生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。
• 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是 不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光 偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均 相检测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
核酸适配体 (aptamer) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成 本低，已广泛应用于分析应用领域
传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理 Biosens. Bioelectron. 2012, 32, 148-154.