质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实

验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；

2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；

4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；

5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温，与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；

B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱：

A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；

B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；

C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 3.质粒DNA的定量分析：

A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；

B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰

/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280= DNA纯净

A260/A280 含RNA杂质，用RNA酶去除。

4.质粒DNA的酶切鉴定：

限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工

具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).

三、材料与方法：实验材料：

仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管

材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2. 质粒DNA的提取与制备

仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管材料：溶液 P1、溶液P2 (S2）、溶液P3、去蛋白液PE漂洗液WB、洗脱液EB 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4.

质粒DNA的酶切鉴定

仪器：的EP管、微量加样枪

材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统

材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液

实验方法

准备目的DNA：菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液

2. 质粒DNA的提取与制备

将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作：①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃——30 秒，50℃——30 秒，72℃——1 分钟。循环为30次③72℃ 5 分钟④4 ℃保温将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心取 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水μl、2*Premix μl、引物1 (10 mol/L) 1μl、引物2 (10 mol/L) 1μl、菌液5μl 13000rpm x 1min，弃上清取培养物加入Eppendorf管中

加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬

浮加入250μl 溶液S2，颠倒4～6次混匀，直到溶液变得清亮加入350μl 溶液S3，立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min，小心取上清液将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2，13000rpm离心1min ，弃滤液；重复一遍加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液

3. 质粒DNA的定量

取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm 离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用空柱13000rpm 离心1min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发再向比色皿加入2ul的质粒DNA，于紫外分光空白对照比色测定向比色皿加入98ul蒸馏水，进行Blank调零清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馏水刷洗，2~3次。并用滤纸擦拭干净

光度计上进行‘sample’测定，记录相关数据

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；

2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方