流式细胞术急性分离小鼠小胶质细胞

流式细胞术急性分离小鼠小胶质细胞

实验步骤

1. 小鼠用pH值7.4，0.1M PBS彻底穿心灌注。

2. 用剪刀去头。

3. 剥开头骨的软组织。

4. 除去下颌骨。

5. 除去头骨延髓到上颌骨之间的组织。

6. 手术剪刀，取出头骨顶部，顺时针方向切割，开始和结束于右后鼓膜钩。

7. 舀出大脑，维持组织的完整性。

8. 立即将脑组织置于预冷的流式细胞术缓冲液中（1％BSA 1mM的EDTA的pH值7.4 0.1M PBS，50U/ml DNAseI）。如果计划标记神经元，应在缓冲液中添加l-谷氨酸以防止在制备过程中的神经细胞死亡。

9. 用杜蒙5＃镊子从大脑的外表面仔细剥离脑膜（硬脑膜、蛛网膜和软脑膜）。

10. 使用手术刀作冠状切口分离大脑和小脑/脑干。

11. 使用镊子分离小脑和脑干,小心剥离出第四脑室脑膜衬砌。

12. 使用手术刀，纵向平分，小心剥离出大脑脉络丛及相关的脑膜组织。

13. 进一步解剖到所需分析的脑区（如海马，大脑皮层等）。

14. 将脑组织转移到15MLTenbroeck homogenizer中，其中含有10毫升冰冷的FACS缓冲液。

15. 轻柔震荡3次破碎组织。

16. 粗匀浆，经过70微米尼龙网状带有塑料柱塞的细胞过滤装置，每柱2次，产生单细胞悬液。

17. 离心细胞，4ºC，1200 转/10min，弃掉上清液，再加上细胞流式细胞仪的缓冲液。

18. 用Miltenyi AutoMACS除去髓磷脂，根据指示髓鞘去除珠。

19. 1×流式细胞仪缓冲液洗细胞，4ºC，1100转/10min，弃掉上清液。细胞重置在100 UL 预冷的，细胞流式细胞术的缓冲液中再转至细胞流式细胞仪管中。

20. 把细胞标记上带有抗CD11b，CD45的细胞外的小胶质标记物、可修复的LIVE/DEAD 染料或者任何其他所需标记（例如GFAP，NeuN，CD3e等），4度避光反应30min。

21. 洗涤细胞2次，如步骤19所示。

22. 在100-400uL含1％PFA PBS溶液(0.1M，PH=7.4)中重新悬浮细胞。4℃避光存储。

23. 在流式细胞仪检测细胞。

24. 首先用LIVE/DEAD设置gate，选择活细胞，然后依据脉冲宽度与面积比选择线性分布细胞，依据前向散射与侧散射比来消除碎屑。然后依据不同细胞类型的相应标记来获得等效和准确的细胞计数。

小胶质细胞分离流程示意图，如图1