氯霉素眼药水的高效液相色谱分析
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吸取待测溶液约25μL，进样，记录5分钟，得色谱图。
色谱条件：
色谱仪 岛津LC-15C高效液相色谱 色谱柱 C18柱（5µm，150×4.6mm） 柱温 室温 流动相 甲醇∶水（ 70 ∶ 30 ） 流速 1.000ml/min 波长 272nm
色谱操作步骤：
1、依次打开检测器、泵的开关 2、打开电脑主机，打开操作界面 3、排气泡 4、设置色谱条件，打开泵开关 5、让流动相冲洗色谱系统，至色谱基线水平，约半小时 6、基线调零，填写数据文件名及信息 7、单次运行，进样并记录数据 8、数据处理及打印报告 9、关氘灯，冲洗色谱系统约半小时，关机。
目的要求：
1、了解高效液相色谱的基本原理 2、了解高效液相色谱仪的结构及正确使用 3、学习外标法测定组分的含量
Байду номын сангаас谱的发明人
色谱起源
俄国科学家：M. S. Tswett 提出经典液相色谱
石油醚
流动相：携带样品流过 整个系统的流体
固定相：静止不动的一 相，色谱柱
色素混合物 碳酸钙颗粒
植物的石油醚提取液在 碳酸钙吸附剂填充的玻 璃管中分离出叶绿素及 其他色素
氯霉素含量的测定
1、对照品配制（0.1mg/mL) 精密称取25.0mg氯霉素样品，用5mL甲醇溶解，用7:3的
水:甲醇溶液稀释至250.0mL，配制成0.1mg/mL的对照品溶液 2、眼药水样品配制
精密吸取眼药水10mL，用7:3的水:甲醇溶液稀释至 250.0mL，配制成眼药水的稀释溶液
3、色谱测试 用清洗溶剂清洗微量进样针三次，用待测溶液润洗三次，
mV
❖ 色谱是一种分离技500术.
400
❖ 色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量 300
Methyl Paraben Ethyl Paraben Propyl Paraben Butyl Paraben
200
100
0
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
通阀
排放
排放
其结构如图所示：
进样
进样
定量环
装填状态
进样状态
六通阀是很好的定量装置，使得 高效液相色谱的进样量得到准确 的控制。
色谱柱（C18柱，ODS）
ODS柱是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱；由于它是 长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，适合分 离有机物，因此在分析工作中应用的最为广泛。
其主要成份氯霉素，辅料为硼酸、 硼沙、氯化钠、防腐剂等
氯霉素
外标一点法
样品 20uL
成份 A
眼药水稀 释液
峰面积A样品
色谱定量： 峰面积与样品浓度 成正比。
对照品 20ul
已知浓度 的氯霉素 溶液
成份 A
峰面积A对照
A样品 A对照 C样品 C对照
条件：需要已知浓度的标准样品 待测成分与杂质间分离良好
是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段： • 高精度、耐高压的输液泵 • 高性能的色谱柱 • 高灵敏度的检测器
HPLC特点
• 分离性能好 • 灵敏度高（10-9～10-12 g） • 选择性高（同分异构，旋光异构） • 分析速度快 • 进样量小（1-100 mL）
HPLC应用领域
• 药物分析（抗生素、维生素） • 临床分析（药物代谢） • 化学品（邻苯二甲酸、醛、酮、药物中间体） • 环境（多环芳烃、农残、微嚢藻毒素） • 食品（孔雀石绿、苏丹红） • 生命科学（蛋白质、多肽）
9
液相色谱的基本流程图
流动相 预备柱
进样阀 色谱柱
高压泵
高压输 进样 液系统 系统
①②
分离系统
③
11
常用的高效液相色谱仪
LC-15C
美国Agilent
美国Waters
日本岛津
4.2.2 高效液相色谱主要部件
(1) 泵输液系统
主要部件之一，压力：15～35MPa。提供高压流动相 应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特性。
(2) 进样装置
泵
泵
流路中为高压力工作状
柱
柱
态，通常使用耐高压的六
色谱 分离组分
色谱法分离的基本原理：
A+B+C
C B AC
B AC
BC ABC
各组分性质结构差异 与固定相相互作用差异 反复多次分配平衡(吸附—解吸)
信
随流动相移动的速度不等
号
AB C
保留时间不同
色谱洗脱过程与色谱图 t，min
达到分离效果
色谱定义
• 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分 离的技术
气体 (gas,G)
GSC GLC
GBPC
液体
超临界流体
(liguid,L) (supercrttical fluid,SF)
LSC
SFSC
LLC
SFLC
LBPC
SFBPC
气相色谱 液相色谱 超临界色谱
HPLC
• 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 – 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 分析 – 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
常用流动相：水、甲醇、乙腈
紫外检测器
• 目前最普遍的检测器 • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
朗伯—比尔定律
lg I Ecl I0
眼药水中的氯霉素
氯霉素滴眼液 用于治疗由大肠杆 菌、流感嗜血杆菌、克雷伯菌属、金黄 色葡萄球菌、溶血性链球菌和其他敏感 菌所致眼部感染，如沙眼、结膜炎、角 膜炎、眼睑缘炎等。 为无色或几乎无 色的澄明液体。
检测器 检测系统
④
AB C DE G F
记录系统
⑤
HPLC分析过程
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子， 待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入 进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分 依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收 集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变 成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色 谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
min
生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为
信号强度，横坐标为保留时间。
保留值
V=t.Fc；Fc为流动相流速
W1/2 W
保留体积VR 调整保留体积V'R 死体积V0 峰面积 相对保留值 保留指数
区域宽度 W1/2=2.335σ W=4σ
液相色谱
按流动相与固定相的分子聚集状态分类
流动相 固定相
固体(solid,S) 液体(liguid,L) 化学键合相 (bonded phase,BP)
色谱条件：
色谱仪 岛津LC-15C高效液相色谱 色谱柱 C18柱（5µm，150×4.6mm） 柱温 室温 流动相 甲醇∶水（ 70 ∶ 30 ） 流速 1.000ml/min 波长 272nm
色谱操作步骤：
1、依次打开检测器、泵的开关 2、打开电脑主机，打开操作界面 3、排气泡 4、设置色谱条件，打开泵开关 5、让流动相冲洗色谱系统，至色谱基线水平，约半小时 6、基线调零，填写数据文件名及信息 7、单次运行，进样并记录数据 8、数据处理及打印报告 9、关氘灯，冲洗色谱系统约半小时，关机。
目的要求：
1、了解高效液相色谱的基本原理 2、了解高效液相色谱仪的结构及正确使用 3、学习外标法测定组分的含量
Байду номын сангаас谱的发明人
色谱起源
俄国科学家：M. S. Tswett 提出经典液相色谱
石油醚
流动相：携带样品流过 整个系统的流体
固定相：静止不动的一 相，色谱柱
色素混合物 碳酸钙颗粒
植物的石油醚提取液在 碳酸钙吸附剂填充的玻 璃管中分离出叶绿素及 其他色素
氯霉素含量的测定
1、对照品配制（0.1mg/mL) 精密称取25.0mg氯霉素样品，用5mL甲醇溶解，用7:3的
水:甲醇溶液稀释至250.0mL，配制成0.1mg/mL的对照品溶液 2、眼药水样品配制
精密吸取眼药水10mL，用7:3的水:甲醇溶液稀释至 250.0mL，配制成眼药水的稀释溶液
3、色谱测试 用清洗溶剂清洗微量进样针三次，用待测溶液润洗三次，
mV
❖ 色谱是一种分离技500术.
400
❖ 色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量 300
Methyl Paraben Ethyl Paraben Propyl Paraben Butyl Paraben
200
100
0
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
通阀
排放
排放
其结构如图所示：
进样
进样
定量环
装填状态
进样状态
六通阀是很好的定量装置，使得 高效液相色谱的进样量得到准确 的控制。
色谱柱（C18柱，ODS）
ODS柱是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱；由于它是 长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，适合分 离有机物，因此在分析工作中应用的最为广泛。
其主要成份氯霉素，辅料为硼酸、 硼沙、氯化钠、防腐剂等
氯霉素
外标一点法
样品 20uL
成份 A
眼药水稀 释液
峰面积A样品
色谱定量： 峰面积与样品浓度 成正比。
对照品 20ul
已知浓度 的氯霉素 溶液
成份 A
峰面积A对照
A样品 A对照 C样品 C对照
条件：需要已知浓度的标准样品 待测成分与杂质间分离良好
是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段： • 高精度、耐高压的输液泵 • 高性能的色谱柱 • 高灵敏度的检测器
HPLC特点
• 分离性能好 • 灵敏度高（10-9～10-12 g） • 选择性高（同分异构，旋光异构） • 分析速度快 • 进样量小（1-100 mL）
HPLC应用领域
• 药物分析（抗生素、维生素） • 临床分析（药物代谢） • 化学品（邻苯二甲酸、醛、酮、药物中间体） • 环境（多环芳烃、农残、微嚢藻毒素） • 食品（孔雀石绿、苏丹红） • 生命科学（蛋白质、多肽）
9
液相色谱的基本流程图
流动相 预备柱
进样阀 色谱柱
高压泵
高压输 进样 液系统 系统
①②
分离系统
③
11
常用的高效液相色谱仪
LC-15C
美国Agilent
美国Waters
日本岛津
4.2.2 高效液相色谱主要部件
(1) 泵输液系统
主要部件之一，压力：15～35MPa。提供高压流动相 应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特性。
(2) 进样装置
泵
泵
流路中为高压力工作状
柱
柱
态，通常使用耐高压的六
色谱 分离组分
色谱法分离的基本原理：
A+B+C
C B AC
B AC
BC ABC
各组分性质结构差异 与固定相相互作用差异 反复多次分配平衡(吸附—解吸)
信
随流动相移动的速度不等
号
AB C
保留时间不同
色谱洗脱过程与色谱图 t，min
达到分离效果
色谱定义
• 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分 离的技术
气体 (gas,G)
GSC GLC
GBPC
液体
超临界流体
(liguid,L) (supercrttical fluid,SF)
LSC
SFSC
LLC
SFLC
LBPC
SFBPC
气相色谱 液相色谱 超临界色谱
HPLC
• 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 – 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 分析 – 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
常用流动相：水、甲醇、乙腈
紫外检测器
• 目前最普遍的检测器 • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
朗伯—比尔定律
lg I Ecl I0
眼药水中的氯霉素
氯霉素滴眼液 用于治疗由大肠杆 菌、流感嗜血杆菌、克雷伯菌属、金黄 色葡萄球菌、溶血性链球菌和其他敏感 菌所致眼部感染，如沙眼、结膜炎、角 膜炎、眼睑缘炎等。 为无色或几乎无 色的澄明液体。
检测器 检测系统
④
AB C DE G F
记录系统
⑤
HPLC分析过程
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子， 待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入 进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分 依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收 集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变 成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色 谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
min
生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为
信号强度，横坐标为保留时间。
保留值
V=t.Fc；Fc为流动相流速
W1/2 W
保留体积VR 调整保留体积V'R 死体积V0 峰面积 相对保留值 保留指数
区域宽度 W1/2=2.335σ W=4σ
液相色谱
按流动相与固定相的分子聚集状态分类
流动相 固定相
固体(solid,S) 液体(liguid,L) 化学键合相 (bonded phase,BP)