美国热电：奶粉中阪崎肠杆菌检测方法比较

备注：原有的 PCR 体系是 25 µl，而 Eppendorf 公司推出的 Mastercycler® ep realplex 荧光定量 PCR 仪最小体系是 5 µl，在 这里我们为您设计了 10 µl 的反应体系。小体积的反应体系不但节省试剂成本还可以节省 DNA 模板，同时提高反应速度。
3、 定量 PCR 反应步骤
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一些改进的培养方法 同样获得一致的检测 结果，且效率大大提 高，时间缩短
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假阳性可以通过规范化的实验规程或选用 荧光定量 PCR 方法得到改善
对荧光定量 PCR 方法用于阪崎肠杆菌检测结果 进行解释前，对生产、销售和使用的全过程的了 解是很有必要的
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随着食品质量安全控制的重点由单一终产品的质量检验向食品生产加工全过程监控的转变，对 有害微生物进行快速检验和定量，就显得尤其必要，以 PCR 为基础的分子生物学快速检测值得 推广
结晶紫中性红葡萄糖琼脂 （VRBGA）平板或 显色培养基平板 胰化大豆蛋白琼脂平板
氧化酶试验，革兰氏染色 API 20E 生化鉴定试剂盒 或其他鉴定系统
辅助试验 观察黄色素产生
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realplex ᕩЏ߿᧙ 1$3 ̀
- 快速银制荧光定量 PCR 仪
报 告
升降温速度：+ 6℃ / - 4.5℃
荧光定量 PCR 标准检测流程
模板 DNA 制备 Eppendorf 系列产品
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- Reference 移液器 可整支高温高压灭菌
将 1 ml EE 肉汤，加入 1.5 ml 无菌离心管
8,000 rpm 离心 5 分钟
取上清液，加入 50 µl DNA 提取液 混匀，沸水浴 5 分钟 12,000 rpm 离心 5 分钟
第一步 第二步 ຝऎ 37℃ 预变性：95℃ 变性：95℃ 退火、延伸：60℃ 4℃ 保温 备注：Eppendorf 公司的 Mastercycler® ep realplex 中的银制模块荧光定量 PCR 仪，升降温速度可以达到 6℃/s、4.5℃/s， 可以进一步优化。 ௐᫍ 5 min 3 min 5S 40 S 检测 FAM 40 循环 ೜฽ᕩЏζՁ ९ဖஜ
奶粉中阪崎肠杆菌检测方法及其比较
目前， 阪崎肠杆菌的实验室检测方法包括 ： 改进的传统检测方法（经典方法） 、 普通 PCR 方法与荧光 PCR 方法（快速筛选方法） 。 FAO/WHO（联合国粮农组织 / 世界卫生组织）在 2004 年召开了 2 次国际相关会议，与会专家倡导采用国际通用的分子生物 学方法，以弥补传统方法的局限性。
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- 5424 小型高速离心机 最高转速可达 14,680 rpm， 容量：24 孔 ×1.5 ml 离心管
荧光定量 PCR 检测
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- Thermomixer comfort

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混匀功能 1400 rpm 转速 制冷加热功能
（室温下 13℃ - 99℃）
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结晶紫中性红胆盐琼 脂平板培养符合革兰 阴性无芽孢肠杆菌生 化特征
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培养基准备，平板培 养，菌落记数，生化 鉴定
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4-6 天 （1）无特殊设备要求 （2）方法经典可靠 （3）可直观判断细菌 活与死
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（1）检测周期长，费 时费力 （2）在结晶紫中性红 胆盐琼脂平板上，该 菌与肠杆菌科其它某 些 菌 菌 落 形 态 相 似， 可操作性差
Eppendorf 荧光定量 PCR 检测体系
1、 模板 DNA 的制备
从 EE 肉汤中分别提取 1 ml 加到 1.5 ml 无菌离心管中，8000 r/min 离心 5 min，取上清液，加入 50 µl DNA 提取液，混匀后 沸水浴 5 min，12000 r/min 离心 5 min，取上清液以待检测。
2、 定量 PCR 检测体系构建
10×PCR 缓冲液 dNTP F- 引物 R- 引物 探针 DNA 模板 H2O ใऎ 200 mmol/L 10 mmol/L 10 µmol/L 10 µmol/L 5U / µl 25 µl ԥःͳጆ 2.5 1 1 1 0.5 2 17 10 µl ԥःͳጆ 1 0.4 0.4 0.4 0.2 0.8 6.8
奶粉中病源微生物的分子生物学检测
前 言
随着经济的发展以及人们对先进技术掌握的逐步完善，奶粉 中病源微生物导致的安全和健康问题，引起了人们对病源微 生物检测的重视。本文以目前奶粉中最新关注的病源微生物 阪崎肠杆菌的生物学检测为例，借助 Eppendorf 高品质的 实验室仪器家族，帮您构建奶粉中病源微生物检测的分子生 物学平台。 阪崎肠杆菌（ Enterobacter sakazakii ）是人和动 物 肠道 内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科的一种。 该菌在一定条件下可引起人和动物致病，因此被称为条件致 病菌。 2005 年 5 月 20 日，由中国检验检疫科学研究院和天津检 验检疫局牵头完成的《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标 准在京通过审定。该标准的建立为管理部门提供了更有效的 执法依据，为企业质量控制提供了有力的技术手段，对降低 婴幼儿配方奶粉的风险，保证代乳品的安全性具有十分重要 的意义。 多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿 脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，故配方奶 粉中阪崎肠杆菌污染问题成为世界瞩目的焦点。
项目
经典方法
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分子生物学方法（快速筛选方法）
ᕩЏ߿᧙ PCR ழก 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号累积，实时检测整个 PCR 过程，最后通过标 准曲线对模板进行定量分析 （1） 荧光定量 PCR： 一次性加好各种反应物后，在荧光定量 PCR 扩 增仪中进行 （2）扩增完成进行中或完成后进行数据分析 细菌 16S-23S rDNA 间区序列（ITS）的 可变区存在着种属间的差异性，利用阪崎 肠杆菌 ITS 特有的序列设计引物，扩增出 特异性基因片段 （1）普通 PCR： 一次性加好各种反应物后，在 PCR 扩增 仪中进行 （2）普通 PCR 的后处理： PCR 扩增结束后，可以采用多种方法对 扩增产物进行分析 最常用的包括： 凝胶电泳分析、 分子杂交、 限制性内切酶分析、核酸序列分析 3-5 小时 2 小时内 普通与荧光定量 PCR 共同优点： （1）利用阪崎肠杆菌 ITS 特有的序列，特异性强 （2）灵敏度高，对于细菌学最小检出可达到 3-10 个细菌 （3）操作简便快速 荧光定量 PCR 独有特点 （1）无需 PCR 后处理，大大减少假阳性错误 （2）节省 PCR 后处理时间，样品通量提高 （3）利用参考基因对扩增效率进行标化，检测重 复性提高 （4）更大的动力学范围，定量结果更可信 普通 PCR 由于灵敏度很高，因此极微量 的扩增前污染，扩增后电泳点样和杂交点 样时的交叉污染都可能导致假阳性 不能区分活且生长、活而不长和死的细菌