血清球蛋白的分离纯化与鉴定

实验血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定

【实验目的】

1.熟悉蛋白质分离提纯的技术路线

2.掌握盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。

【实验原理】

血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α_1 -球蛋白、α_2 -球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白室一类结构及功能相似的蛋白质，绝大多数免疫球蛋白属于γ-球蛋白，因此γ-球蛋白的分离纯化在医学研究中非常重要。

蛋白质的分离纯化室研究蛋白质结构及其生物功能的重要手段。分离提纯γ-球蛋白时，首先利用各种清蛋白在中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，因为中性盐可使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定因素去除而沉淀。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，而33%的饱和硫酸铵溶液只能使γ-球蛋白沉淀，α-球蛋白和β-球蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有γ-球蛋白的醋制品。

用盐析法分离而得的γ-球蛋白中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析（凝胶过滤）法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异将蛋白质与无机盐分离。当溶液通过SephadexG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在凝胶柱中会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液可能仍含有其他球蛋白，利用它们等电点的不同，通过DEAE（二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析可进一步分离、纯化出γ-球蛋白。因为α-球蛋白、β-球蛋白的pI﹤6.0；γ-球蛋白的pI为7.2左右。因此，在pH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同，经DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；而带正电的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合从而直接从层析柱流出。由于随洗脱液流出的只有γ-球蛋白，从而使γ-球蛋白粗制品被纯化。

【实验试剂】

1.免疫血清

2.饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵（ammonium sulfate)850g于1000 mL蒸馏水中，在70~80℃水浴中搅拌溶解，用浓氨水调pH为7.2，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上层液即为饱和硫酸铵溶液。

3.pH 7.2磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS)：称取NaH2 PO4·2H2 O 1.56 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为0.01 mol/L NaH2PO4液。称取Na2 HPO4·12H2 O 3.58 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为0.01mol/L Na2 HPO4液。取0.01 mol/LNaH2 PO4液280 mL，加0.01mol/L Na2HPO4液720 mL，混匀即为0.01 mol/L，pH 7.2磷酸盐缓冲液。

4.葡聚糖凝胶G-25（Sephadex G-25)：按每100 mL凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G-25干胶25g。称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸馏水约30 mL，用玻璃棒轻轻混匀，置于90~100℃水温中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2~3次，然后加0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡，备用。

5.奈氏试剂（Nessler"s reagent)：

①贮存液：称取碘化钾(KI) 150g、碘110g、水100ml，移入250mL锥形瓶

中，再加入汞150g，分别摇荡10~15分钟，至碘完全溶解，此时溶液温度逐渐升高，由红色变为浅棕色，将锥形瓶置于流水下冷却，继续摇荡，至溶液为米黄色为止，倾入溶液置2000ml容量瓶中，将沉淀用水多次洗涤倾入瓶中，然后加水2000ml刻度，混匀。

②应用液：倒上述溶液30ml，加入10％NaOH 140mL，加水30mL混匀，即为奈试试剂（奈试试剂的主要成分室碘化钾汞复盐）。

6.双缩脲试剂硫酸铜250g加水100ml，加热助溶，取酒石酸钠钾10g、碘化钾5g溶于500ml水中，再加20% NaOH 30ml，混匀，然后将硫酸铜溶液倾入，加水至1000ml。

7.浓蔗糖溶液—饱和蔗糖溶液

8.DEAE-32(二乙基氨基乙基-32）纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE 纤维素14g称取，每克加0.5mol/L盐溶液15ml，搅拌。放置30min（盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质）。加约10倍量的蒸馏水搅拌，放置片

刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液（也可用布氏漏斗抽干），直至上清液pH﹥4为止。加等体积1mol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸去除上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH﹤7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3）平衡，备用。

9.0.0175mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH6.3）

10.20%磺基水杨酸溶液

11.电泳所需试剂。

【实验步骤】

1.盐析

⑴取正常人血清1.0 mL加入离心管中，加磷酸盐缓冲液（PBS)1.0 mL稀释血清，混匀。再逐滴缓慢加入pH 7.2饱和硫酸铵液2.0 mL，边加边摇匀。静置10分钟后离心（4000 rpm×10分)，小心将上清液（此液中主要含清蛋白)倾入试管中（留供后面实验用），并尽量倒净，沉淀为球蛋白。

⑵将上述离心管中的沉淀用0.5 mL PBS溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵液

0.25ml，混匀，静置10分钟后离心（4000 rpm×10分钟)，倾去上清液（此液中主要含α、β-球蛋白)并尽量倒净，其沉淀为初步纯化的γ-球蛋白(如要获得更纯的γ-球蛋白，可重复此过程1~2次），最后用5滴PBS将沉淀溶解。

2. 脱盐

⑴装柱：取层析柱（Φ1×20cm)，关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加入已经备好的葡聚糖凝胶G-25悬液，待底部沉积1~2 cm厚的凝胶后，打开下端出口，继续加入凝胶至凝胶沉淀10~15 cm高（注意凝胶装填均匀，若分多次加入凝胶应在放胶前将柱内凝胶顶部搅动悬起，再将凝胶液倾入，凝胶床表面应平整且液面始终高于凝胶面），凝胶柱经PBS流洗平衡后用螺旋夹调节PBS缓冲液的流速，控制在每分钟6滴。

⑵上样与洗脱：用滴管吸出γ-球蛋白液，将滴管插入层析柱内，在缓冲液几乎全部进入凝胶层时，管口靠近凝胶面缓慢滴入3滴蛋白质液，待全部蛋白质液进入凝胶层后，小心用滴管轻轻靠近凝胶面加入PBS缓冲液10滴，待进入凝胶柱床后再加入PBS缓冲液10滴，如此重复三次（注意不要破坏凝胶床表面的平整），再陆续小心加入PBS缓冲液5~10ml，保持液面始终高于凝胶面。洗脱