第5章 将DNA引入活
分子生物学 第五章 DNA的转座
转座作用
DNA的转座，或称移位，是由可移位因子介导 的遗传物质重排现象。
“转座”？
不十分准确，在转座过程中，可移位因子的一个 拷贝常常留在原来的位置上，在新位点出现的是 拷贝，因此，转座有别于同源重组，它依赖于 DNA的复制。 根据转座子复制与否，转座作用可分为:
单纯转移 复制转移
5.1转座子 转座子
5.4.3 TnA家族 家族
TnA家族都是比较大的转座子（-5kb以上）， 家族都是比较大的转座子（ 以上）， 家族都是比较大的转座子 以上 其特点是两端不含IS， 其特点是两端不含 ，但含有独立的转位酶基 因和抗药性基因。 因和抗药性基因。TnA家族包括许多类似的转 家族包括许多类似的转 位子。它们的一般结构均相类似， 位子。它们的一般结构均相类似，但有不同的 遗传标记(genetic markers)。 遗传标记 。
5.4.1 Tn10 许多转位子两端的IS具有完全相同的反向 许多转位子两端的 具有完全相同的反向 或同向）重复顺序。但亦有些Tn两端 两端IS不 （或同向）重复顺序。但亦有些 两端 不 完全相同，从而引起其功能各异。例如Tn10 完全相同，从而引起其功能各异。例如Tn10 两端的IS（右侧IS10R，左侧为 两端的 （右侧 ，左侧为IS10L）即不 ） 完全相同。 完全相同。
IS10L Tn10 (9.3 kb) IS10R
IR IR
பைடு நூலகம்IR
IR IR
IR
两端的反向重复顺序长22bp。这 在IS10两端的反向重复顺序长 两端的反向重复顺序长 。 个22bp的反向重复即是转位酶所赖以识 的反向重复即是转位酶所赖以识 别的位点，因而为转位反应所必须。 别的位点，因而为转位反应所必须。由 的反向重复不完全相同， 于IS10R和IS10L的反向重复不完全相同， 和 的反向重复不完全相同 所以IS10R是Tn10转位所必须，而IS10L 转位所必须， 所以 是 转位所必须 的转位活性却仅为IS10R的1-10％（目前 ％（目前 的转位活性却仅为 的 ％（ 估计IS10R和IS10L之间约有 ％的差 之间约有2.5％ 估计 和 之间约有 异）。
第五章细菌基因重组及遗传分析
第一节 转化（Transformation）
转化：是指受体细胞在特定生理条件下吸收外源DNA分子或 片段，并能表达外源DNA性状的过程。转化现象的发现和转 化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨 大的推动作用。 转化是导致细菌基因重组的主要途径之一，转化现象在自然 环境中普遍存在于许多细菌中，包括一些革兰氏阳性菌和阴 性菌，只是转化频率很低。
转化的两个例子： ①.用两个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合, 可以发现带有双抗性的细菌。 细菌裂解 DNA残留 其它细菌摄取转化
②.枯草杆菌活细胞表面分泌DNA，可被其它细 胞摄取。
通过化学和非常规培养等方法处理受体细胞，不仅可以提高 转化频率，也可使遗传转化发生在自然条件难以转化或不能 转化的微生物中。 在实验室条件下，通常用CaCl2 、cAMP、低温培养、PEG 介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过 程大体可分为三个阶段： 感受态的出现 DNA的吸附和进入 DNA的整合
如果a和b是连锁的，当DNA浓度降低时，ab共转化频率 的下降和a或b的转化频率的下降相同。假如a和b不连锁， ab共转化频率的下降将远远超过a或b的转化频率。
因为在较低浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成 正比关系，如果两个基因在同一DNA分子上，那么浓度降 低10倍时，两个基因同时转化的概率也将减少10倍。 如果两个基因不在同一DNA分子上，DNA浓度下降时， 两个基因同时转化的概率将减少100倍，而不是10倍。
例外---流感嗜血菌（G-）
转化小体
转化的双链DNA （30-50kb）结 合到膜受体上
双链DNA被转 化小体摄取
然而，不同的细菌摄取DNA 的方式也不尽相同。在流感 嗜血菌中，其感受态细胞形成 一种结合双链DNA的膜结构， 称为转化小体 （transformasome）。该 小体吸附DNA后，与细胞的 内外膜相融合而转入细胞内 侧。进入细胞质前，再将双 链变成单链DNA。
第5章DNA复制
第5章DNA复制一、填空题1.在DNA合成中负责复制和修复的酶是。
2.染色体中参与复制的活性区呈Y开结构，称为。
3.在DNA复制和修复过程中，修补DNA螺旋上缺口的酶称为4.在DNA复制过程中，连续合成的子链称为，另一条非连续合成的子链称为。
5.如果DNA聚合酶把一个不正确的核苷酸加到3端，一个含35活性的独立催化区会将这个错配碱基切去。
这个催化区称为酶。
6.DNA后随链合成的起始要一段短的，它是由以核糖核苷酸为底物合成的。
7.复制叉上DNA双螺旋的解旋作用由催化的，它利用来源于ATP水解产生的能量沿DNA链单向移动。
8.帮助DNA解旋的与单链DNA结合，使碱基仍可参与模板反应。
9.DNA引发酶分子与DNA解旋酶直接结合形成一个单位，它可在复制叉上沿后随链下移，随着后随链的延伸合成RNA引物。
10.如果DNA聚合酶出现错误，会产生一对错配碱基，这种错误可以被一个通过甲基化作用来区别新链和旧链的判别的系统进行校正。
11.对酵母、细菌以及几种生活在真核生物细胞中的病毒来说，都可以在DNA独特序列的处观察到复制泡的形成。
12.可被看成一种可形成暂时单链缺口（I型）或暂时双链缺口（II型）的可逆核酸酶。
13.拓扑异构酶通过在DNA上形成缺口超螺旋结构。
14.真核生物中有五种DNA聚合酶，它们是A.—；B._；C._；D._；E._；15有真核DNA聚合酶和显示35外切核酸酶活性。
16.原核生物DNA复制的主要酶是，真核生物中DNA复制的主要酶是17、大肠杆菌RNA聚合酶的为a288’。
18、噬菌体人的复制原点结构含、1和三种独特序列。
19、在DNA复制中，在dUTPase突变菌株中，冈崎片段变。
在尿嘧啶-N-糖苷酶突变菌株中，冈崎片段变。
20.DNA拓扑异构酶是与有关的酶.旋二、选择题（单选或多选）1.DNA的复制（）。
A.包括一个双螺旋中两条子链的合成B.遵循新的子链与其亲本链相配对的原则C.依赖于物种特异的遗传密码D.是碱基错配最主要的来源E.是一个描述基因表达的过程2.一个复制子是（）。
生物化学第五章核酸化学习题含答案
核酸的化学一、是非题1．嘌呤碱分子中含有嘧啶碱结构。
2．核苷由碱基和核糖以β型的C—N糖苷键相连。
3．核苷酸是由核苷与磷酸脱水缩合而成，所以说核苷酸是核苷的磷酸酯。
4．核苷酸的碱基和糖相连的糖苷键是C—O型。
5．核糖与脱氧核糖的差别是糖环的2’位有无羟基。
6．核苷酸的等电点的大小取决于核糖上的羟基与磷酸基的解离。
7．在DNA双链之间，碱基配对A-T形成两对氢键，C-G形成三对氢键，若胸腺嘧啶C－2位的羰基上的氧原于质子化形成OH，A－T之间也可形成三对氢键。
8．任何一条DNA片段中，碱基的含量都是A=T，C=G。
9．DNA碱基摩尔比规律仅适令于双链而不适合于单链。
10．用二苯胺法测定DNA含量必须用同源的DNA作标准样品。
11．DNA变性后就由双螺旋结构变成线团结构。
12．Tin值低的DNA分子中（A－T）％高。
13．Tin值高的DNA分子中（C-G）％高。
14．由于RNA不是双链，因此所有的RNA分子中都没有双螺旋结构。
15．起始浓度高、含重复序列多的DNA片段复性速度快。
16．DNA的复制和转录部必须根据碱基配对的原则。
17．某氨基酸tRNA反密码子为GUC，在mRNA上相对应的密码子应该是CAG。
18．细胞内DNA的核苷酸顺序都不是随机的而是由遗传性决定的。
19．RNA链的5 ′核苷酸的3′羟基与相邻核昔酸的5′羟基以磷酸二酯键相连。
20．假如某DNA样品当温度升高到一定程度时，OD260提高30％，说明它是一条双链DNA。
21．核酸外切酶能够降解所有的病毒DNA。
二、填空题1．核苷酸是由＿＿＿、＿＿＿＿和磷酸基连接而成。
2．在各种RNA中＿＿含稀有碱基最多。
3．T m值高的DNA分子中＿＿＿的％含量高。
T m值低的DNA 分子中＿＿＿％含量高。
4．真核生物的DNA存在于＿＿＿＿，其生物学作用是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
5．细胞内所有的RNA的核苷酸顺序都是由它们的＿＿＿＿＿＿决定的。
6．将双链DNA放置在pH2以下或pH12以上，其OD260＿＿＿，在同样条件下单链DNA的OD260＿＿＿＿＿＿。
第五章 DNA复制
四、大肠杆菌DN点的识别、DNA解旋及引发体的形成。 • 复制起始位点（Ori）的结构特征：有4个9bp的反向重复序列，这些序列易与DNa A结合；还有3个富含AT的13bp正向序列 ，易解链。 • 详细过程：Dna A携带ATP与Ori中的4个9bp反向重复序列结合，ATP水解释放能 量促进相邻3个富含AT碱基的13bp正向序列解链；这时HU蛋白（一种小分子碱性 细菌细胞类组蛋白）结合到解链部位，诱导DNA双链弯曲，从而加速DNA解链； 与此同时Dna B在Dna C帮助下，结合于解链区，促使DNa G与之结合，形成一个 沿某一方向移动的引发复合物。 2、复制的延伸：前导链与后随链的合成。 • 前导链：由引发体引发RNA引物合成，由5’→3’在DNA聚合酶Ⅲ的作用下正常合 成DNA子链。 • 后随链的合成可以用回环模型解释： a) 当两条链同时复制时，后随链经过复制叉的部位就形成一个回环，以适应双链同 时向前进行和保证后随链DNA合成方向也是5’→3’，这种复制模型称为回环模型。 b) 冈崎片段合成的“四步循环曲”：后随链模板形成回环，聚合酶Ⅲ与引发体都与 之结合，准备引物合成；引物按5’→3’方向合成，由于模板呈环状，所以引物行进 方向就是复制叉行进方向；模板链环不断扩大，引物所在部位移动到聚合酶Ⅲ所 在部位，启动DNA子链的合成；当DNA合成到距离前一个片段仅剩一小空隙时， 酶脱离模板链，一个冈崎片段便被合成出来。上述四步不断循环，就完成了后随 链的不连续复制，得到一段段分离的冈崎片段。（对照P157图5.27理解） c) 冈崎片段合成后的处理：聚合酶Ⅲ合成的冈崎片段，由聚合酶Ⅰ切除RNA引物， 填补片段之间的空缺，最后由DNA连接酶将它们连接成一条完整的子代链。 3、复制的终止 • 复制终点的结构特征：含有多个22bp的终止子位点，这些终止子位点可以与某些 蛋白结合形成终止复合物，阻断复制叉的前行，从而终止复制。
分子生物学第5章、第6章
•DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为 遗传重组，或基因重排。→ 重组DNA •真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染 色体之间的交换；细菌及噬菌体的基因组为单倍体， 来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传 重组。 •DNA重组对生物进化起着关键的作用。 •重组分类：同源重组(homologous recombination) 、 位点特异性重组(site-specific recombination)、 转座重组(transposition recombination)和 异常重组(illegitimate recombination)。
1. 互变异构体：碱基发生烯醇式-酮式互变异构或者氨 基-亚氨基互变异构时，使碱基错配。 2. 脱氨基作用：碱基上氨基自发脱落，或在诱变剂的 作用下脱去氨基，则C→U、A →I、G →X，引起子 链错误。 3. DNA聚合酶“打滑”：DNA复制时发生碱基的环出现 象，引起一个或数个碱基的插入或缺失，易发生于 几个相同碱基串联的部位。 4. 活性氧（O3）引起的诱变：①氧化碱基与C、A配对， 造成GC → TA颠换，这种损伤可以积累；②H2O2造成 的DNA氧化损伤，此类损伤一般能被修复。
核苷酸切除修复
错配修复
错配修复对 DNA复制忠实 性的贡献力达 102-103，DNA 子链中的错配 几乎完全都被 修正，充分反 映了母链的重 要性。
大肠杆菌甲基化引 导的错配修复
重组修复
易错修复和SOS反应
•SOS反应：当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而
诱发出一系列复杂的反应。
•这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。
5.3.4 基因突变的后果
基因突变的后果主要是生物功能的丧失。 某一基因突变后使其所表达的蛋白质或酶失活， 有时还会引起多种酶的缺乏。 有些突变可产生功能获得性显性表现型。 典型的人体细胞突变每个基因每代发生率为107～10-5，但并非所有的突变都会导致疾病。
人教版-生物-高二-选修一教案：第五章-第一节-DNA的粗提取与鉴定 Word版含答案
教学目标1、理解DNA的理化特性及根据其理化特性而提取和鉴定的原理，初步掌握DNA的粗提取和鉴定方法。
2、理解相关溶液的作用机理，培养学生的分析能力，通过实验使学生能够简述科学探究的基本过程。
3、通过探索培养科学的怀疑精神和创新精神；通过实验结果，学生树立生命物质性的观点。
教学重难点教学重点：提取DNA的相关原理和步骤教学难点：提取DNA的相关原理和步骤教学工具教学课件教学过程（一）导入新课现状：很多学校很难开展“DNA的粗提取与鉴定”实验原因：1.实验的成功率普遍较低；2.背景知识较多；3.操作相对复杂，学生不易准确地操控实验。
（二）、提取生物大分子的基本思路1、选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
对于DNA的粗提取而言．就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2、探究实验原理：屏幕展示表格1不同浓度的NaCl溶液可溶解或析出DNA。
95%酒精可提取DNA。
（1）在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；（2）在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；（3）当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
填表1：填表2：通过对实验原理的预习，表格的比较，使学生明确了各溶液的用途，保证理解实验。
3.DNA的粗提取实验原理1）不同浓度NaCl中DNA溶解度不同。
2）DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同，DNA不溶于酒精，细胞中某些蛋白质则溶于酒精。
3）DNA和蛋白质对酶耐受性不同：酶的专一性——蛋白酶水解蛋白质。
但是对DNA没有影响。
4）DNA和蛋白质对高温耐受性不同：蛋白质、DNA热稳定性不同。
大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
5）DNA和蛋白质对洗涤剂耐受性不同：洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
提取DNA的原理包括DNA的溶解性和耐受性两个方面。
生物化学 第五章 核酸化学习题含答案
核酸的化学一、是非题1．嘌呤碱分子中含有嘧啶碱结构。
2．核苷由碱基和核糖以β型的C—N糖苷键相连。
3．核苷酸是由核苷与磷酸脱水缩合而成，所以说核苷酸是核苷的磷酸酯。
4．核苷酸的碱基和糖相连的糖苷键是C—O型。
5．核糖与脱氧核糖的差别是糖环的2’位有无羟基。
6．核苷酸的等电点的大小取决于核糖上的羟基与磷酸基的解离。
7．在DNA双链之间，碱基配对A-T形成两对氢键，C-G形成三对氢键，若胸腺嘧啶C－2位的羰基上的氧原于质子化形成OH，A－T之间也可形成三对氢键。
8．任何一条DNA片段中，碱基的含量都是A=T，C=G。
9．DNA碱基摩尔比规律仅适令于双链而不适合于单链。
10．用二苯胺法测定DNA含量必须用同源的DNA作标准样品。
11．DNA变性后就由双螺旋结构变成线团结构。
12．Tin值低的DNA分子中（A－T）％高。
13．Tin值高的DNA分子中（C-G）％高。
14．由于RNA不是双链，因此所有的RNA分子中都没有双螺旋结构。
15．起始浓度高、含重复序列多的DNA片段复性速度快。
16．DNA的复制和转录部必须根据碱基配对的原则。
17．某氨基酸tRNA反密码子为GUC，在mRNA上相对应的密码子应该是CAG。
18．细胞内DNA的核苷酸顺序都不是随机的而是由遗传性决定的。
19．RNA链的5 ′核苷酸的3′羟基与相邻核昔酸的5′羟基以磷酸二酯键相连。
20．假如某DNA样品当温度升高到一定程度时，OD260提高30％，说明它是一条双链DNA。
21．核酸外切酶能够降解所有的病毒DNA。
二、填空题1．核苷酸是由＿＿＿、＿＿＿＿和磷酸基连接而成。
2．在各种RNA中＿＿含稀有碱基最多。
3．T m值高的DNA分子中＿＿＿的％含量高。
T m值低的DNA 分子中＿＿＿％含量高。
4．真核生物的DNA存在于＿＿＿＿，其生物学作用是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
5．细胞内所有的RNA的核苷酸顺序都是由它们的＿＿＿＿＿＿决定的。
6．将双链DNA放置在pH2以下或pH12以上，其OD260＿＿＿，在同样条件下单链DNA的OD260＿＿＿＿＿＿。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
第五章 DNA的复制3
真核生物DNA聚合酶
不同生物的DNA复制体系
三、SV40的DNA复制 的 复制
SV40（simian virus 40）病毒只编 码一个蛋白质T抗原，以供基因组复 制的需要，其他复制所需要的蛋白 质由宿主细胞提供。 SV40 DNA的复制发生在宿主细胞 核中，在病毒和细胞DNA复制之间 有很多相似之处，这使SV40病毒成 为研究真核生物细胞DNA复制的理 想模型体系。
隔膜
控制DNA复制重新起始的机制还不是 完全清楚，可能会包括以下几种情 况： ① 复制起点的物理隔离 ② 再甲基化的延迟 ③ DnaA对复制起点的结合 ④ dnaA基因转录的抑制
真核生物的基因组是由许多复制子 （replicon）组成的，每个复制子的 复制起点在一个细胞周期内同样也只 能被激活一次。 问题的实质集中在以下两个问题上： ① 调节系统是如何识别已经发生复制的 起点的？ ② 有哪些蛋白质成分参与了这些调控过 程？
Rapid growth and preparation for DNA synthesis DNA synthesis and histone synthesis phase
S
G0
Quiescent cells
静止的
G1
phase
phase
M
phase
G2
Growth and preparation for cell division
在半甲基化阶段，复制起点是无活 性的（ inert ），而且dnaA的表达也 受到抑制，DNA复制的起始蛋白的 产量很低。 已经确定，SeqA基因的突变可以缩 短oriC和dnaA再甲基化所需要的时 间。SeqA与半甲基化状态DNA的结 合力比与全甲基化DNA结合力更强。
10-第05章-2基因组注释-实验验证
因 数目
1）生物的复杂性与其所含的基因数目并不成比例，高等植物如葡萄 的基因数目比人类多出800多个。2）基因数并不等同于蛋白质数。 由于基因通过pre-mRNA的可变剪接可产生多个甚至数十个mRNA， 使其编码蛋白质的潜能大大增加。复杂生物mRNA可变剪接的数目 远多于简单生物。
人类基因组的 基因注释
1) 上调基因的表达： 基因过表达 (gene overexpression)
2）破坏基因的表达： 基因剔除（gene knockout） 下调表达（Knockdown）: 如RNAi, 基因组编（ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9, CRISPRi）
转基因过表达
检测基因功能
Simonet WS等在老鼠肠组织 中发现一个全长cDNA，它 所编码的蛋白属于肿瘤坏 死因子受体（ TNFR）家 族成员，具有可分泌糖蛋 白特点，但功能未知。将 其导入小鼠细胞获得转基 因过表达小鼠。表型检测 发现，这个被称之为骨保 护素(OPG)的蛋白在骨骼 发育中可调控成骨细胞和 骨吸收细胞之间的平衡， 以剂量依赖方式影响小鼠 的骨骼发育。
全长cDNA克隆
MMLV逆转录酶以mRNA为 模板合成单链cDNA，到 达模板mRNA的5 ’端时 会在互补单链cDNA的3’ 端添加额外的数个CCCC-碱基。利用这一特 点，人工合成5 ’XXXXXGGGG-3 ’引物， 与单链cDNA的5’-CCCC -互补，可合成全长单链, 并进一步合成双链cDNA。 如果单链cDNA的合成不 能到达mRNA的5’末端， 这些cDNA的扩放将终止。 最终获得的都是全长双 链cDNA。
确 定 基 因 边 界
GIS（gene identification signature, 基因鉴别信号）是一种确定定接头，获取成对末端标签。随后构 建成对末端，测序后将末端序列锚定到基因组DNA。
第5章-5人类基因组计划简介ppt课件
反对的声浪
人类基因组计划虽然是一个极富创意的想法, 但在当时 的许多方面都超出了科学技术发展的实际水平, 因而不 可避免遭到各方面的怀疑与反对, 其中包括像Jacob 这样大名鼎鼎的生理学Noble 奖得主, MIT和NIH(美 国国家健康研究所)等著名单位. 主要原因在以下几点: 1) 科学上的依据: 基因编码序列仅占人类基因组总量
为何要用分子标记进行 基因组作图
基因组测序的基本策略是将整个基因组分 割成一些小的片段分别测序, 然后将测序的 片段进行组装, 使其回归到原来的位置. 为了确保分散的基因片段正确归位组装, 必 须寻找一批标记,它们在染色体上的位置是 已知的、唯一的、确定的, 并位于不同的测 序片段之中.
基因组路标(landmarker)
WA 7. Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT, Cambridge, MA 8. Washington University Genome Sequencing Center, St. Louis, MO 2) United Kingdom 9. The Sanger Centre, Hinxton
4) France
13. Genoscope, Evry
5) Japan
14. Keio University, Tokyo 15. RIKEN Genomic Sciences Center, Saitama
6) China
16. 中国华大基因中心: 于1998年申请参加人类基因组3号染色体端部约1%基
人类基因组测序的耗费
The overall budget needs for the effort are still anticipated to be the same as those identified by the OTA and the NRC, namely about $200 million per year for approximately 15 years. (引自:The First Five Years: Fiscal Years 1991-1995, published April 1990. DOE/ER-0452P, NIH Publication No. 90-1590.)
第5章-思考题解析
51.试述PCR扩增的原理和步骤。
答：PCR技术是体外快速扩增特异DNA序列的一种方法。
基本原理：通过模拟体内DNA复制的方式，在体外以DNA为模板，4种脱氧核苷酸为原料，用特异引物为延伸起点，在DNA聚合酶的催化下，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，完成特定基因的体外复制。
步骤：○1变性，双链DNA模板在高温下解开成单链；○2退火，温度降低后引物与模版的特定序列相结合；○3延伸，DNA聚合酶催化新链DNA合成。
最终这三步经过多次循环后使两条引物间DNA区段的拷贝数呈指数增加，从而短时间内获得所需的大量的特定基因序列。
2.试比较常规重组载体构建和恒温一步法载体构建的异同点。
答：常规重组载体构建过程：○1合成目的基因片段两端的引物；○2PCR扩增目的基因；○3对目的基因和质粒载体进行双酶切（用相同的外切核酸酶）；○4 T4 DNA连接酶将酶切后目的基因和质粒载体连接成一个整体，连接温度为22℃时，1～2 h完成连接，4℃或16℃连接时，需要反应8 h以上完成连接反应。
恒温一步法载体构建：其主要特征是载体与片段的连接不依赖T4 DNA连接酶。
主要过程：○1将载体线性化，通过引物设计在插入片段两端引入线性化载体的末端序列；○2PCR扩增插入片段后，其两端具有与线性化载体末端相同的序列；○3按一定比例加入插入片段和线性化载体，再加入dNTP，在T5外切核酸酶、DNA聚合酶和TaqDNA连接酶的混合催化下，50℃恒温反应15～30min即可完成连接反应。
3.比较荧光染料SYBRGreenⅠ和TaqMan荧光探针的主要不同点。
答：SYBRGreenⅠ荧光探针：1种荧光，波长520nm；加入到PCR反应体系中的荧光染料SYBRGreenⅠ仅能与双链DNA结合，被激发出绿色荧光，其荧光强度反映PCR产物的产量，可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，但是不能区分不同的双链DNA。
TaqMan荧光探针：含有短波长和长波长2种荧光。
新教材高中生物第5章第1节基因突变和基因重组学案新人教版必修2
第1节 基因突变和基因重组课标内容要求核心素养对接1．概述碱基的替换、增添或缺失会引发基因中碱基序列的改变。
2．阐明基因中碱基序列的改变有可能导致它所编码的蛋白质及相应的细胞功能发生变化。
3．描述细胞在某些化学物质、射线以及病毒的作用下，基因突变概率可能提高，而某些基因突变能导致细胞分裂失控，甚至发生癌变。
4．阐明进行有性生殖的生物在减数分裂过程中，染色体所发生的自由组合和交叉互换，会导致基因重组，从而使子代出现变异。
1．生命观念：用结构和功能观，说出基因突变和基因重组的物质基础；运用进化与适应观，理解基因突变和基因重组与生物进化的关系。
2．科学思维：采用概括与归纳，理解基因突变和基因重组的概念。
3．科学探究：基于证据，论证基因突变和基因重组是可遗传的变异。
4．社会责任：认同健康的生活方式，远离致癌因子。
一、基因突变的实例：镰状细胞贫血(也叫镰刀型细胞贫血症) 1．实例(如图)(1)图示中的a 、b 过程分别代表DNA 的复制和转录，基因突变发生在a(填字母)过程中。
(2)直接原因：组成血红蛋白分子的肽链中的一个谷氨酸被缬氨酸替换。
(3)根本原因：发生了基因突变，碱基对由=====T A ――→替换为=====AT。
(4)病理诊断：镰状细胞贫血是由于基因的一个碱基对改变引起的一种遗传病，是基因通过控制蛋白质的结构，直接控制生物体性状的典例。
2．概念DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变。
3．基因突变对后代的影响(1)若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代。
(2)若发生在体细胞中，一般不能遗传。
但有些植物的体细胞发生了基因突变，可以通过无性生殖遗传。
二、细胞的癌变1．细胞癌变的机理2．癌细胞的特征三、基因突变的原因、特点和意义1．基因突变的原因(1)外界因素(连线)(2)内部因素：DNA复制偶尔发生错误。
2．基因突变的特点3．基因突变的意义(1)对生物体的意义①大多有害：破坏生物体与现有环境的协调关系。
5-目的基因的重组导入
转化 加入 1mLSOC 培养液
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
（3） 平板 培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
4.转化率和影响转化率的因素
每gDNA转化成功的细菌克隆数 总受体细胞所获的转化成功的细菌数
（1）重组质粒
①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。
收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培 养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不
高（106-108/gDNA）。
10ng载 体DNA 100L感 受态菌 10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42º C 1.5分钟
二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外 源DNA。
1
葡聚糖 DEAE
预处理
细胞
摄入
外源DNA
2
外源DNA
混合
细胞
吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可 以进入到细胞核里。 DEAE对细胞有毒!
本章思考题（3）
1、重组DNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？ 2、受体的选择有什么要求？ 3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？ 4、导入植物细胞的方法有哪些？ 5、导入动物细胞的方法有哪些？ 6、简述各种重组DNA导入法的优缺点。
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量
（2）用碱性磷酸酶处理载体
5’
3’ 插入片段
载体
载体和外源DNA插入片段的连接结果
受体细胞：
原核生物细胞
真核生物细胞 酵母菌细胞
高中生物 第5章 基因突变及其他变异 第1节 基因突变和基因重组教案高中生物教案
第1节 基因突变和基因重组1．实例：镰状细胞贫血(1)图示中a 、b 、c 过程分别代表DNA 复制、转录和翻译。
基因突变发生在a(填字母)过程中。
(2)人们患镰状细胞贫血的直接原因是血红蛋白异常，根本原因是发生了基因突变，碱基对由=====A T 替换成=====TA。
2．概念3．基因突变对后代的影响(1)若发生在配子中，将传递给后代。
(2)若发生在体细胞中，一般不能遗传。
但有些植物的体细胞发生了基因突变，可以通过无性生殖遗传。
二、细胞的癌变 1．细胞癌变的机理 2．癌细胞的特征三、基因突变的原因、特点和意义1．基因突变的原因(1)外界因素(连线)：(2)内部因素：DNA复制偶尔发生错误。
2．基因突变的特点3．基因突变的意义(1)对生物体的意义：①大多有害：破坏生物体与现有环境的协调关系。
②个别有利：如植物的抗病性突变、耐旱性突变等。
③中性突变：既无害也无益，如有的基因突变不会导致新的性状出现。
(2)对进化的意义：①产生新基因的途径。
②生物变异的根本来源。
③为生物的进化提供了丰富的原材料。
四、基因重组1．概念2．类型[填表](1)定义：是生物变异的来源之一，对生物的进化具有重要意义。
(2)理由：有性生殖过程中的基因重组使产生的配子种类多样化，进而产生基因组合多样化的子代，其中一些子代可能会含有适应某种变化的、生存所必需的基因组合，因此有利于物种在一个无法预测将会发生什么变化的环境中生存。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)1．基因突变一定引起基因结构的改变，但不一定引起生物性状的改变。
( ) 2．在致癌因子的作用下，正常动物细胞可转变为癌细胞。
( ) 3．若没有外界因素的影响，基因就不会发生突变。
( ) 4．减数分裂四分体时期，姐妹染色单体的局部交换可导致基因重组。
( )5．基因重组只能产生新基因型和重组性状，不能产生新基因和新性状。
( ) [答案]1．√2．√3．×提示：突变是普遍存在的，在DNA复制的时候，碱基有可能发生错配。
第五章 目的基因与载体连接 2
第五章目的基因与载体的连接内容提要•基因重组克隆与亚克隆•基因重组对载体的要求与载体类型•连接前的处理•黏性末端连接•平端连接•人工接头连接•同聚寡核苷酸末端连接第一节基因重组克隆与亚克隆外源基因的获取载体的选择与构建外源基因与载体的切割与修饰外源基因与载体的连接（DNA体外重组）目的基因的表达重组DNA导入受体细胞重组体的筛选体外重组就是指目的基因与载体DNA的连接。
基因重组是靠DNA连接酶将适当切割的DNA即目的基因与载体共价连接。
DNA连接酶能催化相邻或两侧的DNA上裂口核苷酸裸露的3’-羟基和5’-磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。
在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶——T4连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
注意：在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。
一、体外连接重组DNA的特点1、DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；2、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；3、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
基因重组克隆实质上就是DNA体外重组以及后续的转化过程。
亚克隆是指把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。
例如：重组λ-噬菌体质粒亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的程序。
注意：进行连接反应时，要考虑载体DNA与DNA片段的比率。
例如：以自质粒载体形成环状分子，1：1。
以λ噬菌体或cos质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。
第二节基因重组对载体的要求与载体类型根据重组连接的目的，可将载体分为克隆载体和表达载体。
一、克隆载体如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建DNA文库，可以选择一般的克隆型载体。
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5.4 重组噬菌体的鉴别
5.4.4 基于λ基因组大小的筛选 包装体系只能将大小37~52Kb的DNA分子 插入到噬菌体的头部结构中 插入型载体（第六章）通常删除了噬菌体 的中非必须的基因部分，因此中有重组后 介于37~52Kb的分子才能被包装。
5.5 将DNA引入非细菌细胞
酵母细胞的转化 植物原生质体的转化 植物体的转化 动物细胞系的转化等
5.4 重组噬菌体的鉴别
5.4.3 Spi-（sensitive to P2 inhibition）正选择 A 野生型λ噬菌体，不能在P2噬菌体溶源性细菌中 生长，为Spi+，即对在P2噬菌体的抑制成敏感反应。 B λ噬菌体载体中的red和gam区段被外源片段取代 后， λ噬菌体就能在P2噬菌体溶源性细菌中生长。
正常状态下的细菌细胞获取外源DNA的能力有限
5.1.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
过冷的盐处理的大肠杆菌的细胞比未处理 的细胞获取外源DNA的能力要高。
感受态细胞：经过一些物理或化学处理后， 具备增强了获取外源DNA能力的细胞，称 为感受态细胞。
感受态细胞能增强获取外源DNA能力的可能机理： Ca 2+离子与细胞膜磷脂层形成液晶结构、促使内 外膜之间核酸酶解离形成感受态。 Ca 2+离子能与DNA结合形成形成羟基——磷酸钙 复合物（抵抗DNAase）并能吸附在细胞外膜表面 上。
5.1 转化—使细菌细胞获取DNA
转化：指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进 入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持与表达 的过程。 5.1.1 不同种类的细菌获取DNA的效率不同 自然条件中，外源DNA被细菌吸收后，会被降 解
1)裸露的线性DNA分子，易遭到核酸酶的攻击 2）细菌细胞具有修饰限制系统，识别自我和非我的DNA分子
5.2.1 pBR322重组体的筛选—抗生素 抗性基因的插入失活
在BamHI 位点插入 外源DNA分子， 就不再赋予寄主细 胞耐受四环素的性 质 重组的pBR322分子 保持氨苄青霉素抗 性，为ampRterr 筛选重组的pBR322 分子的方法（p83）
缺点：需要两轮筛选
5.2.2 α互补
5.2.2 α互补 （蓝白斑筛选，LacZ互补）
α互补（蓝白斑筛选，LacZ互补）
5.3 将噬菌体DNA引入细菌细胞
5.3.1 转染(transfection): 类似质粒的转 化，将重组的λ噬菌体DNA分子导入到 受体细胞内并稳定遗传的过程。
5.3.2 λ克隆载体的体外包装
体外包装：
模拟λ噬菌体DNA分子在宿主细胞内发生的包装 过程，将重组的λ噬菌体DNA分子包装成成熟的 具有感染能力的λ噬菌体颗粒
Mature phage particles
5.3.3 噬菌斑
λ噬菌斑（plaque） M13 噬菌斑
5.4 重组噬菌体的鉴别
5.4.1 lacZ’基因功能选择方法 类似于质粒中的蓝白斑筛选 5.4.2 cI基因功能选择法 cI 插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生 型正常的噬菌斑是“浑浊”的
热击破坏液晶结构，细胞膜结构出现间隙，为 DNA分子提供进入细胞的通道。
5.1.3 对转化细胞的选择 （含目标质粒的细胞）
通过质粒所携带基因的表达情况来进行检 测
大都数的质粒克隆载体赋予寄主细胞耐受 抗生素的表型，通过寄主细胞获得的表型 来进行筛选 细胞转化后的复苏阶段的目的：培养细胞 产生足够多的分解抗生素的产物，利于后 续的在平板中的生长。
（蓝白斑筛选，LacZ互补）
正常野生型的大肠杆菌编码能利用乳糖的 基因，包含LacZ基因，编码ß -半乳糖苷酶（乳糖
操纵子的结构） 基因工程的工程菌通常将该基因修饰，使其缺少 编码ß -半乳糖苷酶α-肽段的序列
在载体上加入一段含编码ß -半乳糖苷酶α-肽段
LacZ’基因 如果载体上的LacZ’基因不被破坏（未插入外源 DNA分子），通过载体与宿主细胞中两段基因产 物的互补，可形成有活性的ß -半乳糖苷酶
必要性：
λ噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效率较低， 而在试验过程中，因内切酶的处理，DNA的连接 产生的有效分子等原因，使得转染效率更低
5.3.2 λ克隆载体的体外包装
5.3.2 λ克隆载体的体外包装
单菌株体系 缺陷型λ噬菌体在cos位点有突变， λ噬菌体 的DNA复制不能完成，但可形成外壳蛋白， 可以制备包装所必须的各种外壳蛋白。
第五章 将DNA引入活 细胞（受体细胞）
受体细胞：从实验技术上讲是能摄取外源DNA并 使其稳定维持的细胞。从实验目的上讲是有应用 价值和理论研究价值的细胞。
受体细胞的选择所遵循的原则： 1）便于重组DNA的导入 2）能使重组DNA稳定的存在于细胞中。 3）便于重组体的选择。
பைடு நூலகம்
5.3.2 λ克隆载体的体外包装
3 双菌株的体外包装原理 A λ噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行
B 头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部 C 尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部 D 两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体 外装备形成有活性的噬菌体颗粒
Lyse, mix
Add ATP and concatemerized λ DNA
4）遗传稳定性高。
5）安全性高，无致病性。
6）受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏好。
重组DNA分子引入活细胞，随着活细胞的 生长和分裂产生克隆 克隆的目的
A)产生大量的重组DNA分子 B）纯化目的分子
连接产物中包含的分子类型：
未连接的载体分子 未连接的DNA分子 自连的载体分子 重组的DNA分子 携带插入错误DNA片段的重组分子
5.2 重组体的鉴定
转化子：导入外源DNA后能稳定存在的受体 细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 阳性克隆：含有目的DNA的重组子。 通过各种方法将DNA导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆的过程称为筛选。 通过载体上携带的基因特点来进行筛选：如 抗性标记、插入失活、插入表达、颜色互补 等。
5.2.2 α互补
（蓝白斑筛选，LacZ互补）
在实验过程中，加入乳糖类似物X-gal，被ß -半乳糖苷 酶分解可产生蓝色的化合物
由于载体上具有抗生素抗性基因，赋予了宿主细胞抗 生素抗性能力，因此在这类的克隆中？
当载体上的LacZ’基因被破坏（插入了外源DNA分 子），不能形成有活性的ß -半乳糖苷酶，因此在这类 克隆中具备？