结核分枝杆菌Rv3425蛋白的原核表达纯化及其血清学诊断价值

合集下载

3种结核分枝杆菌复活促进因子基因的克隆、原核表达与纯化鉴定

ＡＳＲＣ：ｏｅｐｅｓｎｕｉｈｅｅｎｏｉｅｕｃａｉｎｐｏｔｇｆｃｏ（ｐＢ）Ｄ（ｐＤ）ＥｒｆＢＴＡＴＴｘｒｓｄｐｒｙｔｅｇｎｓｃｄｎｒｓｓｉｔ－ｒｍｏｉａｔｒＢｒｆ，ｒｆ，（ｐＥ）ｏａｆｅｇｔｏｎｆ
ｉｔＥＴ３ａ＋）ｖｃｏ，ｈｎｔａｓｏｍｅｎｏＥｏｉＴｏ１．ｔｒｉｅｔｆｉｇｂｅｔｉｔｎｄｇｓｉｎａｄＤＮＡｅｕｎｉｇ。ｎｏｐ２（ｅｔｒｔｅｒｎｆｒｄｉｔｃｌｐ０Ａｆｅｄｎｉｙｎｙｒｓｒｃｉｉｅｔｎｏｏｓｑｅｃｎ
Ｍｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｏｉ，ｈｓｅｅｒｍｐｉｅｙＰＣＲｆｏｔｅｇｎｍｅｏ．ｕｅｃｌｓｓＨ３ＲｖｓｒｉａｄｃｏｅｃｂｃｅｉｍｅｃｌｓｓｔｅｅｇｎｓｗｅｅａｌｉｄｂｕｆｒｍｈｅｏｆＭｔｂｒｕｏｉｔａｎ，ｎｌｎｄ７
ｒｆｖ并获得了３种高纯度的重组蛋白，以后的深入研究奠定了基础。ｐＥ，为
关键词：核分枝杆菌；ｐ；隆；达；化结ｒ，克表纯中图分类号：３８９文献标识码：Ｒ７．１Ａ
Ｃｌｎｉｇａｒｋａｙｔｃｅｐｒｓｉｎｏｅｓｅｏｎｅｕｃｔｔｏ－ｏｎｎｄｐｏｒｏｉｘｅｓｏｆｇｎｅｎｃｄｉｇｒｓｓｉａｉｎｐｏｏｉｇｆｃｏｓｆｏｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｌｓｓａｔｕｉｉａｉｎｒｍｔｎａｔｒｒｍＭｃｂｃｅｉｍｕｅｃｏｉｎｄｉｓｐｒｆｃｔｏ

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

ｓｏｐｏｅｎｉｃｌｉｎｒｔｉｎＥ．ｏｉＢＩ２１，ｔ０８ｃｇｎｅｗａｍｐｌｉｄｂｈｅＲｖ６７ｅｓａｉｅｙＰＣＲｒｆｆｏｍｎｇｅｏｍｉＮＡｆＭＴＢ３ｃＤｏＨ７Ｒｖｓｒｉｔａｎ，ａｄｃｏｄｉｎｌｎｅｎｔｈｅｖｃｏｒｐＤ１一．Ｔｈｅ０８ｃｗａｕｂｃｏｄｉｏｔｘｐｒｓｉｎｖｅｔＩ３（）ａｔｒｉｎｔｆｉｇｂｙｒｓｒｃｅｎ— ｏｔｅｔＭ８ＴｎＲｖ６７ｓｓｌｎｅｎｔｈｅｅｅｓｏｃｏｒｐＥ＇２ａ＋、ｆｅｄｅｉｙｎｅｔｉｔｄｅｚｍｅｉｅｔｏｎａｙｓｄｇｓｉｎｄＤＮＡｅｅｉｇ．ＴｈｅｃｎｓｒｃｅｅｏｂｉａｌｓｉａｒｎｓｏｒｅｎｏＥｆｌＢＩ２，ａｄｅｐｅｓｄｓｑｕｎｃｎｏｔｕｔｄｒｃｍｎｎｔｐａｍｄｗｓｔａｆｍｄｉｔｏｉ１ｎｘｒｓｅ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ｏｓｒｃｈｆｅｐｅｓｏｌｓｄｏｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｏｉ，ａｄｔｘｒｓｎｕｉｙｔｅｆ — ＴｏｃｎｔｕｔｔｅＲｐＡｘｒｓｉｎｐａｍｉｆＭｃｂｃｅｉｍｕｅｃｌｓｓｎｏｅｐｅｓａｄｐｒｈｕｆ
赵善民，江鹰，赵勇，毛峰峰，张彩勤，晓雅，冰，长宏郭白师
摘要：目的构建结核分枝杆菌（ｃｂｃｒｕｕｅｃｌｓ，ＢｐＡ的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达、ＭｙｏａｔｉｍｔｂｒｕｏｉＭＴ）Ｒｆｅｓ并纯

结核分枝杆菌特异PE_PPE蛋白家族研究进展

[基金项目] 首都特色临床医学技术发展研究项目(Z08050703080801)[作者简介] 吴静希,女,硕士研究生,主要研究方向:预防医学[作者单位] 1.解放军307医院呼吸科,北京 100071;2.西北农林科技大学,陕西杨凌 712100[通讯作者] 李艳,T e:l 010-********,E-mai:l li yan m d @yahoo .c o 结核分枝杆菌特异PE /PPE 蛋白家族研究进展吴静希1,2,李艳1[摘要] 结核分枝杆菌(M y cobacter i um.t uberculos is ,MT B)是结核病的病原菌。

富含甘氨酸的独特蛋白质家族)))PE /PPE 蛋白家族编码基因约占整个M TB 菌基因组的10%,该蛋白家族可能是细菌毒力和抗原变异的主要来源,对其结构和生物学功能的研究将对结核感染的血清学诊断和结核菌苗的开发具有重要意义。

[关键词] 结核分枝杆菌;PE /PPE 蛋白;生物学功能[中图分类号] R 378.911[文献标志码] A[文章编号] 1674-9960(2011)02-0158-04Advances in research on s pecific PE /PPE proteins fa m ilies fro m M ycobacteriu mtuberculosisWU J ing-x i 1,2,LI Yan1*(1.Depart m ent of R esp ira tory D i sease ,H ospita l N o .307o f PLA,B eiji ng 100071,China ;2.N o rt hwest A g ricu lture and Fo restry U n i ve rsity ,Y ang li ng ,Shaanx i 712100,Chi na)*C orres ponding au t hor ,T e:l 010-********,E-m ai:l liyanm d @yahoo .co [Abstract] M ycobacteriu m tuberculosis (M TB)i s a pathogen i c bacter i a o f t uberculosis .pro li ne -g l uta m ic ac i d(PE)/pro -li ne -pro li ne -g l uta m ic acid(PPE)genes ,accounti ng f o r approx i m ate l y 10%of the coding capacity o f the MT B geno m e ,en -code g lyc i ne -rich pro te i ns carry i ng PE or PPE m o tifs found near the N-ter m i nal and hence na m ed the PE /PPE prote i ns fa m ili es .T he prote i ns fa m ili es m ay play a ro l e i n virulence and an ti gen ic var i a ti on .Investigati ng the struc t ure and biolog i ca l functi on of PE /PPE prote i ns m ay serve as po ten tia l targ ets for the sero l og ica l diagnosis and vacci ne deve lop m ent .[K ey words] M y cobacter i um tuberculosis ;PE /PPE pro te i ns ;b i o log ical f uncti on 结核分枝杆菌(M ycobacteriu m.tuberculosis ,M TB)是结核病的病原菌,全球约有1/3的人口感染M TB,每年约有200万人因结核病致死。

结核分枝杆菌Rv3425Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

㊀２０１９,３５(１)中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e sD O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０１８．００．２１１论㊀著结核分枝杆菌R v ３４２５ＧR v １１６８c蛋白融合表达与血清学评价胡永亮１,２,孙卫国２,张灵霞２,梁晓博１国家科技重大专项(N o ．２０１３Z X １０００３００６),解放军第３０９医院面上课题(N o ．２０１６M S Ｇ００１)胡永亮与孙卫国同等贡献通讯作者:梁晓博,E m a i l :l i a n gx i a o b o ３０９＠１２６．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００１Ｇ８５７０Ｇ８２１６作者单位:１．中国人民解放军第３０９医院皮肤科,北京㊀１０００９１;２．解放军第３０９医院结核病研究所,全军结核病防治重点实验室,结核病诊疗新技术北京市重点实验室,北京㊀１０００９１摘㊀要:目的㊀原核表达结核分枝杆菌R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(E L I S A )方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值.方法㊀以结核分枝杆菌H ３７R v 基因组为模板,通过重叠P C R 扩增得到R v ３４２５ＧR v １１６８c 全核酸序列克隆至表达载体p E T Ｇ２４b 中,转入大肠杆菌B L ２１(D E ３)进行诱导㊁表达和纯化,通过E L I S A 检测１００份确诊结核病人㊁２０例非结核呼吸疾病患者㊁１００份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性.结果㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经E L I S A 方法测定,在血清学实验中敏感性为５４％,特异性为９５％.结论㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值.关键词:结核分枝杆菌;R v ３４２５蛋白;R v １１６８c 蛋白;血清学诊断中图分类号:R １８３㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０１９)０１－０００１－０４F u s i o n e x p r e s s i o n i n p r o k a r y o t i c s y s t e ma n d s e r o l o gi c a l e v a l u a t i o n o f M yc o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s R v ３４２５ＧR v １１６８c p r o t e i n HU Y o n g Ｇl i a n g １,２,S U N W e i Ｇg u o ２,Z H A N GL i n gＧx i a ２,L I A N G X i a o Ｇb o １(１．D e p a r t m e n t o f D e r m a t o l o g y ,t h e ３０９t h H o s p i t a l o f P ．L ．A ,B e i j i n g ,１０００９１,C h i n a ;２．A r m y T u b e r c u l o s i sP r e v e n t i o na n dC o n t r o lK e y L a b o r a t o r y ,B e i j i n g K e y L a b o r a t o r y o f N e wT e c h n i q u e so f Tu b e r c u l o s i s D i a g n o s i s a n dT r e a t m e n t ,I n s t i t u t e f o rT u b e r c u l o s i sR e s e a r c h ,t h e ３０９t h H o s p i t a l o f P L A ,B e i j i n g １０００９１,C h i n a )A b s t r a c t :I no r d e r t o o b t a i n f u s i o n p r o t e i nR v ３４２５ＧR v １１６８c o f M yc o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s e x p r e s s i o n ,p u r i f i c a t i o n i n p r o Ｇk a r y o t i c s y s t e ma nd t oe v a l u a t e i t s p o t e n t i a l v a l u ef o r t u b e r c u l o s i s s e r o l og i c a l d i a g n o s i s ,w e a m p l i f i e d R v ３４２５ＧR v １１６８c g e n e b yo v e r l a p P C Rf r o m g e n o m e o f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s H ３７R v ．T h e f r a g m e n t sw e r e c l o n e d i n t o p E T Ｇ２４bv e c t o r s ．A f t e r i n Ｇd u c t i o n ,e x p r e s s i o na n d p u r i f i c a t i o n f r o m E ．c o l i B L ２１(D E ３),t h e f e a s i b i l i t y wa s e v a l u a t e do f f u s i o n p r o t e i n f o r c l i n i c a l s e r o Ｇl o g i c a l d i a g n o s i sb y E L I S Aa s s a y w i t h１００T B p a t i e n t s ,２０r e s p i r a t o r yp a t i e n t sw i t han o n Ｇt u b e rc u l o u s a nd １００he a l t h yp e o p l e s e r a ．R v ３４２５ＧR v １１６８cf u s i o n p r o t e i nw a s h igh l y e x p r e s s e d ,s e n si t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y w e r e a b o u t ５４％a n d ９５％w i t h t u b e r c u Ｇl o s i s s e r o l o g i c a l d i a g n o s i s ．R e c o m b i n a n t p r o t e i ns h o w e da s t r o n g a n t i g e n i c a b i l i t y ．R e s u l t s s u g g e s t e dR v ３４２５ＧR v １１６８c p r o t e i n h a da n i m p o r t a n t v a l u e i nd i a g n o s i s o f t u b e r c u l o s i s ,a n dm i g h t b e s e l e c t e da s o n e o f d i a g n o s t i c a n t i ge n s of t u b e r c u l o s i s ．K e yw o r d s :M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ;p r o t e i nR v ３４２５;p r o t e i nR v １１６８c ;s e r o l o g i c a l d i a g n o s i s S u p p o r t e db y t h eN a t i o n a l S c i e n c ea n dT e c h n o l o g y M a j o rP r o j e c t (N o ．２０１３Z X １０００３００６)a n dt h eG e n e r a lP r o g r a m o f ３０９t h H o s p i t a l o fP L A (N o ．２０１６M S Ｇ００１)H uY o n g Ｇl i a n g a n dS u n W e i Ｇg u oh a v e a ne q u a l c o n t r i b u t i o n t o t h i s p a pe r C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :L i a n g X i a o Ｇb o ,E m a i l :l i a n gx i a o b o ３０９＠１２６．c o m ㊀㊀结核病是由结核分枝杆菌(M yc o b a c t e r i u mt u Ｇb e r c u l o s i s ,MT B )引起的一种传染性强的慢性传染病,尤其在人口密集地方以及其他传染疾病如艾滋病等并发感染已经呈上升的趋势[１].结核分枝杆菌作为一类人兽共患病病原体能够感染多种宿主,并经多种途径和方式传播,在人体多个器官都能形成感染病灶,引发肺结核㊁肾结核㊁皮肤结核等,而且感１染早期诊断往往由于病症表现不明显而造成误诊[２Ｇ４].对结核病的快速诊断和合理治疗是有效控制结核传染的关键[５],目前结核病的临床检测大都具有明显的缺点,如耗时长㊁特异性差和敏感性低等.利用特异性抗原的结核病血清学快速诊断具有特异性高和敏感性强的特点,有望成为结核病临床诊断首选方法,而从结核菌基因组蛋白中寻找敏感性和特异性强的抗原蛋白则是进行血清学诊断的基础.R v３４２５㊁R v１１６８c蛋白均属于P P E蛋白家族,特点是富含甘氨酸且为结核分枝杆菌所特有,其N 端附近序列为P r oＧP r oＧG l u结构域.R v３４２５属结核菌R D I I区,仅仅存在于致病性分枝杆菌中,该蛋白为免疫显性的B细胞目标抗原,能够用于鉴别肺结核和肺外结核,在临床检测等应用上具有一定价值[６Ｇ７].R v１１６８c蛋白具有很强的保守性,亦属于结核分枝杆菌特有.R v１１６８c蛋白在结核分枝杆菌携带者体内能激发特异的细胞免疫反应,对感染者具有免疫保护性[８Ｇ９].本研究参照以往的工作基础,通过以结核分枝杆菌H３７R v的基因组为模板,采用重叠P C R方法扩增R v３４２５ＧR v１１６８c核酸序列并进行原核表达与纯化,并且通过血清学评价重组蛋白进行临床诊断的可行性,为研制更为有效的结核病免疫诊断试剂以及新型疫苗和新型药物研究打下基础.１㊀材料与方法１．１㊀材料㊀原核表达质粒p E TＧ２４b㊁结核分枝杆菌H３７R v基因组㊁表达菌种B L２１(D E３)均由本实验室保存;质粒提取试剂盒㊁D N A凝胶回收试剂盒购于OM E G A(美国);限制性内切酶㊁T４D N A连接酶㊁T a q D N A聚合酶和d N T P均购于N E B公司;临床确诊结核患者血清由结核病研究所临床检验室提供;非结核呼吸疾病患者血清来自本院呼吸科住院病人;健康人血清来自本院体检中心;引物合成与测序均由北京华大基因公司完成;酶标羊抗人I g G (H R P)购自索莱宝生物工程技术公司;亲和色谱填料购自G E公司;其他生化试剂均为国产分析纯.１．２㊀方㊀法１．２．１㊀引物设计㊀根据结核分枝杆菌R v３４２５㊁R v１１６８c基因序列,设计合成了重叠P C R特异性引物,在R v３４２５N端引物５ᶄ端引入限制性内切酶N d eⅠ位点,在R v１１６８cC端引物３ᶄ端引入限制性内切酶X h oⅠ酶切位点.终止密码子为原核偏好密码子T A A.引物设计如下:P１:５ᶄＧG G A T C C C A T A T G C A T C C A A T G A T A CＧC A G C G G A GＧ３ᶄ;P２:５ᶄＧC T A C A G G G G C G G G G G T G G A G G T G G AＧA G T G C G A A C G C C T G G A A GＧ３ᶄ;P３:５ᶄＧC T T C C A G G C G T T C G C A C T T C C A C C T CＧC A C C C C C G C C C C T G T A GＧ３ᶄ;P４:５ᶄＧT A T G G A G C T C T T A C C G C A G T A T C A CＧT C C GＧ３ᶄ１．２．２㊀R v３４２５ＧR v１１６８c重组质粒的构建与表达㊀以结核分枝杆菌H３７R v基因组为模板,分别用引物P１与P３,P２与P４扩增R v３４２５与R v１１６８c核酸序列,将扩增所得的两段P C R产物混合,１ʒ１００进行稀释后作为模板,用引物P１与P４进行扩增获得R v３４２５ＧR v１１６８c全核酸序列.重叠P C R产物和质粒载体p E TＧ２４b均以N d eⅠ和X h oⅠ进行双酶切,然后在T４D N A连接酶的作用下,将R v３４２５ＧR v１１６８c表达序列克隆到表达质粒p E TＧ２４b中,筛选测序正确的质粒进行保存.取重组工程菌活化后接种于含卡那霉素的L B培养基中,３７ħ条件下震荡培养,在菌液O D６００达到约０．４后,加入I P T G 至终浓度为０．４mm o l/L,在３７ħ,２００r/m i n条件下继续震荡诱导表达７h.离心收集菌体,低温条件下进行超声破碎,１２％S D SＧP A G E分析目的蛋白R v３４２５ＧR v１１６８c的表达水平和存在形式.１．２．３㊀R v３４２５ＧR v１１６８c蛋白复性㊁纯化㊀R v３４２５ＧR v１１６８c蛋白主要以包涵体的表达形式存在.将包涵体用１％的T r i t o nＧX１００洗涤两次,包涵体用８m o l/L尿素和P B S缓冲液充分变性溶解,高速离心收集上清.上清液进行柱上复性,４ħ条件下取上清过镍离子亲和柱,以P B S缓冲液缓慢洗涤,然后分别以５０mm o l/L㊁１５０mm o l/L咪唑洗脱杂蛋白和目的融合蛋白,S D SＧP A G E分析目的蛋白的纯度.对纯化目的融合蛋白进行水透析后以冰干保存.１．２．４㊀R v３４２５ＧR v１１６８c蛋白免疫印迹与E L I S A分析㊀纯化R v３４２５ＧR v１１６８c蛋白经S D SＧP A G E电泳后通过半干法转到P V D F膜上,５％脱脂奶粉封闭１h,洗涤后以３例强阳性人血清和６例健康人血清分别震荡孵育３０m i n,H R P标记的羊抗人I g G孵育１h后,震荡洗涤５次,E C L暗室自动曝光显影分析R v３４２５ＧR v１１６８c蛋白的抗原特异性.以０．０５mm o l/L碳酸钠将R v３４２５ＧR v１１６８c重组蛋白稀释至３μg/m L,包被过夜后,３７ħ封闭２h,P B S T洗板４次;３％B S A于４ħ封闭过夜,洗板５次,分别用临床确诊的１００份临床确诊结核患者血清㊁２０例非结核呼吸疾病患者血清和１００份健康人血清(血清稀释度为１ʒ５０)３７ħ孵育１h,重新２中国人兽共患病学报２０１９,３５(１)洗板若干次,每孔中加入用P B S 稀释成１ʒ１０００的H R P 标记的羊抗人I gG１００μL ,于３７ħ温箱放置１h ,洗板５次,加T M B 显色液置于３７ħ温箱中反应３０m i n 显色,终止反应.酶标仪检测D ４５０n m 波长处的A 值,阳性结果判定以c u t Ｇo f f 值为健康人血清检测平均A 值＋３倍标准差.２㊀结㊀果２．１㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合表达载体的构建㊀通过P C R 方法获得的R v ３４２５与R v １１６８c 核酸序列后再采用重叠P C R 的方法获得R v ３４２５ＧR v １１６８c 核酸全序列,取少量P C R 产物进行１％琼脂糖凝胶电泳分析,结果如图１所示,在目的分子量５３０b p㊁９７０b p ㊁１５１８b p 处分别有清晰的R v ３４２５㊁R v １１６８c 以及R v ３４２５ＧR v １１６８c 条带.双酶切重叠P C R 产物,克隆到载体p E T Ｇ２４b 中,转化至感受态B L (D E ３)细胞.M．D L ２０００;１．R v ３４２５核酸片段;２．R v １１６８c 核酸片段;３．R v ３４２５ＧR v １１６８c 核酸片段图１㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 核酸序列P C R 凝胶电泳鉴定结果F i g ．１㊀G e le l e c t r o ph o r e s i si d e n t i f i c a t i o nr e s u l t so fP C R p r o d u c t so f R v ３４２５ＧR v １１６８c n u c l e i c a c i d f r a g Ｇm e n t２．２㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白原核表达分析㊀将工程菌接种含卡那霉素的L B 培养基中扩大培养,经I P T G 诱导后,低温条件下对菌体超声破碎,S D S ＧP A G E 电泳结果显示(图２),在目的分子量５５k D 处,R v ３４２５ＧR v １１６８c 获得较高表达,但主要以包涵体的形式存在,融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的３０％左右.２．３㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白包涵体复性与纯化㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 包涵体经过初步提纯,在８m o l /L 尿素与P B S 缓冲液的变性条件下进行亲和纯化,分别以５０mm o l /L ㊁１５０mm o l /L 咪唑洗脱杂蛋白和目的融合蛋白,通过S D S ＧP A G E 分析发现(如图３所示),纯化后的融合蛋白纯度可达到９０％以上,对纯化的蛋白按１ʒ１的比例水透析６次后冰M．低分子量蛋白标准;１．未诱导的全菌体蛋白;２．经I P T G 诱导的全菌体蛋白;３．超声上清;４．超声沉淀图２㊀p E T Ｇ２４b ＧR v ３４２５ＧR v １１６８c 原核表达产物S D S ＧP A G E 分析F i g ．２㊀S D S ＧP AG Ea n a l y s i s o f p r o k a r y o t i c e x pr e s s i o n p r o d Ｇu c t s o f p E T Ｇ２４b ＧR v ３４２５ＧR v １１６８c干保存.M．低分子量蛋白标准;１．上样前;２．５０mm o l /L 咪唑洗脱峰;３．１５０mm o l /L 咪唑洗脱峰图３㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白亲和纯化S D S ＧP A G E 分析F i g ．３㊀S D S ＧP AG E a n a l y s i so ft h ea f f i n i t y pu r i f i c a t i o n pr o d u c t s o fR v ３４２５ＧR v １１６８c f u s i o n p r o t e i n ２．４㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白W e s t e r nB l o t 与E L I S A 分析㊀纯化后的R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白经S D S ＧP A G E 电泳后转移至P V DF 膜上,分批次经３例强阳性人血清和６例健康人血清孵育㊁H R P 标记羊抗人二抗结合反应,W e s t e r nB l o t 结果见图４.结果表明,纯化后的R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白能与３例确诊结核病人血清抗体结合,而与健康人对照血清标本不反应,显示重组融合蛋白具有较强的抗原性和特异性.图４㊀R v ３４２５ＧR v １１６８c 与不同人阳性血清W e s t e r nB l o t结果F i g．４㊀W e s t e r nb l o tr e s u l t so ft h er e a c t i o n so fR v ３４２５ＧR v １１６８c f u s i o n p r o t e i nw i t h３T B p a t i e n t s e r a３１期胡永亮等:结核分枝杆菌R v ３４２５ＧR v １１６８c 蛋白融合表达与血清学评价分别以１００份临床确诊结核患者血清㊁２０例非结核呼吸疾病患者血清和１００份健康人血清与R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白进行E L I S A 检测实验,结果如图５所示,其中设定c u t Ｇo f f 值为健康人血清检测平均A 值＋３倍标准差.图５㊀重组R v ３４２５ＧR v １１６８c 蛋白与不同人血清E L I S A结果F i g．５㊀E L I S Ar e s u l t s o f t h e r e a c t i o n s o fR v ３４２５ＧR v １１６８c f u s i o n p r o t e i nw i t h s e r a o f T B p a t i e n t s ,n o n Ｇt u b e r Ｇc u l o u s p a t i e n t s a n dh e a l t h yp e o pl e 统计实验结果为临床确诊结核患者血清阳性检出例数为５４例,检出阳性率为５４％;非结核呼吸疾病患者血清检出１例,检出率为５％;健康人血清检出２例,检出率为２％,特异度为９５％.E L I S A 结果说明,获得的重组融合蛋白R v ３４２５ＧR v １１６８c 在进行结核病血清学检测上具有可观的敏感性和特异性,可用于结核病人的血清学诊断.３㊀讨㊀论造成结核病误诊率和漏诊率高的一个很重要的原因就是对结核分枝杆菌的感染缺乏快捷㊁灵敏的检测方法.目前,临床上主要采用的结核病检测方法包括抗酸染色㊁结核菌培养㊁血清学检测㊁芯片检测等[１０Ｇ１３].其中,血清学诊断由于具有操作简单㊁稳定性强等特点,是诊断结核病的主要研究方向之一.然而,由于血清学诊断对于检测抗原的免疫原性和特异性都有较高的要求,因而在实际操作中也存在一定的局限性,例如敏感度较低㊁特异性差等.因此研究者一直在寻找结核分枝杆菌特异性强的抗原去用于结核病的血清学诊断的研究.P P E 蛋白家族占有结核分枝杆菌全基因１０％的开放阅读框(O R F s ),它们在序列和结构上的特异性在开发新型特异性诊断抗原或者结核疫苗的方面可能具有一定优势[１４].结核分枝杆菌R v ３４２５㊁R v １１６８c 蛋白都是P P E 家族成员,它们除了共有P P E 结构域外,没有其它的共同作用位点,因此不会产生抗原抗体的交叉反应,而且表现出较强的免疫活性,能将结核病患者与B C G 接种者区别开[１５].目前针对结核病的实验室诊断中,还没有一种特异抗原能够在结核患者血清学检测中获得令人满意的结果,本实验室前期工作分别将R v ３４２５蛋白与R v １１６８c 蛋白进行表达和纯化,在进行大量临床样本进行血清学验证时,敏感度分别为４５％和５１％,特异性均可达到９７％以上,虽然在临床血清学验证中取得了较好结果,但敏感性还达不到临床实验室检测的要求[１６Ｇ１７].通过多个特异抗原的融合串联重组可以提高抗原的敏感性,在本实验中我们将R v ３４２５蛋白与R v １１６８c 蛋白进行融合表达和纯化,并采用w e s t e r n Ｇb l o t 和E L I S A 实验来验证融合蛋白的特异性和敏感性.从实验结果看,纯化后的R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白血清学敏感度能够达到５４％,特异度为９５％,相对单个R v ３４２５蛋白或者R v １１６８c 蛋白,敏感性存在一定程度提高.但融合抗原与非结核呼吸疾病患者血清也存在部分交叉反应,其原因可能是融合抗原序列中含有较多的非保守序列,降低了特异性,因此该融合抗原的敏感性和特异性仍后期需扩大样本量进行重复验证.本次实验获得的融合抗原相对其它结核菌抗原具有较为明显的优势,这与我们预期的实验结果基本吻合.此次实验结果提示R v ３４２５ＧR v １１６８c 融合蛋白能够作为结核病诊断的潜在检测抗原,该结果为后期的结核病免疫诊断试剂的研制和开发打下基础.利益冲突:无引用本文格式:胡永亮,孙卫国,张灵霞,等．结核分枝杆菌R v ３４２５ＧR v １１６８c 蛋白融合表达与血清学评价[J ]．中国人兽共患病学报,２０１９,３５(１):１Ｇ４．D O I :１０．３９６９/j ．i s s n ．１００２Ｇ２６９４．２０１８．００．２１１参考文献:[１]A h m e dN ,C a v i e d e sL ,A l a mM ,e t a l ．D i s t i n c t i v e n e s s o f M yc o Ｇb a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s G e n o t y p e s f r o mh u m a n i mm u n odef i c i e n c yv i r u s t y p e １s e r o p o s i t i v e a n ds e r o n e g a t i v e p a t i e n t s i nL i m a ,P e r u [J ]．JC l i n M i c r o b i o l ,２００３,４１(４):１７１２Ｇ１７１６．D O I :１０．１１２８/J C M．４１．４．１７１２Ｇ１７１６．２００３[２]陈秀平．超声对肾结核及其分型的诊断价值和意义[J ]．实用临床医学,２０１６,１７(５):６８Ｇ６９．D O I :１０．１３７６４/j ．c n k i ．l c s y．２０１６．０５．０２６[３]陈慧姮,薛如君,田歆,等．长期误诊的疣状皮肤结核１例[J ]．中国皮肤性病学杂志,２０１７,３１(８):９２５Ｇ９２６．D O I :１０．１９３６７/j．c n k i ．１０００Ｇ２７０７．２０１５．０３．０３６(下转第１０页)４中国人兽共患病学报２０１９,３５(１)M y c o l o g y,２０１７,５５(６):６７３Ｇ６７９．D O I:１０．１０９３/mm y/m y w１２８[８]S a i l s A D,S w a m i n a t h a n B,F i e l d s P I．C l o n a lc o m p l e x e s o fC a m p y l o b a c t e r j e j u n i i d e n t i f i e db y m u l t i l o c u ss e q u e n c et y p i n g c o r r e l a t ew i t h s t r a i n a s s o c i a t i o n s i d e n t i f i e d b y m u l t i l o c u s e n z y m e e l e c t r o p h o r e s i s[J]．JC l i n i c a l M i c r o b i o l,２００３,４１(９):４０５８Ｇ４０６７．D O I:１０．１１２８/J C M．４１．９．４０５８Ｇ４０６７．２００３[９]O l k k o l aS,N y k a S,R a u l o S,e t a l．A n t i m i c r o b i a l r e s i s t a n c e a n d m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p e so f f i n n i s h C a m p y l o b a c t e r j e j u n i i s oＧl a t e s f r o m m u l t i p l e s o u r c e s[J]．Z o o n o s e sP u b l i cH e a l t h,２０１６,６３(１):１０Ｇ９．D O I:１０．１１１１/z p h．１２１９８[１０]K o v a n e nS M,K i v i s t oR I,R o s s iM,e ta l．Ac o m b i n a t i o no f M L S T a n d C R I S P Rt y p i n g r e v e a l sd o m i n a n t C a m p y l o b a c t e r j e j u n i t y p e s i no r g a n i c a l l y f a r m e dl a y i n g h e n s[J]．J A p p l i e d M i c r o b i o l,２０１４,１１７(１):２４９Ｇ２５７．D O I:１０．１１１１/j a m．１２５０３[１１]薛峰,徐飞,栾军,等．多位点序列分型分析空肠弯曲菌华东动物源分离株[J]．微生物学报,２０１０,５０(３):２９８Ｇ３０３．D O I:１０．１３３４３/j．c n k i．w s x b．２０１０．０３．０１５[１２]董俊,韩梅,周康,等．４７株空肠弯曲菌湖北禽源株的多位点序列分型[J]．微生物学报,２０１６,５６(１):１５０Ｇ１５６．D O I:１０．１３３４３/ j．c n k i．w s x b．２０１５０１７５[１３]王新,周婷,孟江洪．禽肉空肠弯曲杆菌的多位点序列分型技术研究[J]．中国食品学报,２０１０,１０(２):１８０Ｇ１８６．D O I:１０．１６４２９/ j．１００９Ｇ７８４８．２０１０．０２．０１８[１４]G r i e k s p o o r P,E n g v a l l E O,O l s e nB,e t a l．M u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g o f C a m p y l o b a c t e r j e j u n i f r o m b r o i l e r s[J]．V e t e r i n a r y M i c r o b i o l,２０１０,１４０(１/２):１８０Ｇ１８５．D O I:１０．１０１６/j．v e t m i c．２００９．０７．０２２[１５]K a r e n l a m p i R,R a u t e l i nH,S c h o n b e r g n o r i oD,e t a l．L o n g i t uＧd i n a l s t u d y o f f i n n i s h C a m p y l o b a c t e r j e j u n i a n dC．c o l i i s o l a t e s f r o m h u m a n s,u s i n g m u l t i l o c u s s e q u e n c et y p i n g,i n c l u d i n g c o m p a r i s o nw i t h e p i d e m i o l o g i c a l d a t a a n d i s o l a t e s f r o m p o u l t r y a n d c a t t l e[J]．A p p l i e dE n v i r o n m e n t M i c r o b i o l,２００７,７３(１):１４８Ｇ１５５．D O I:１０．１１２８/A E M．０１４８８Ｇ０６[１６]R a g i m b e a u C,S c h n e i d e rF,L o s c h S,e ta l．M u l t i l o c u ss eＧq u e n c et y p i n g,p u l s e dＧf i e l d g e le l e c t r o p h o r e s i s,a n df l as h o r t v a r i a b l e r e g i o nt y p i n g o fc l o n a lc o m p l e x e so f C a m p y l o b a c t e r j e j u n i s t r a i n so fh u m a n,b o v i n e,a n d p o u l t r y o r i g i n s i nL u xＧe m b o u r g[J]．A p p l i e dE n v i r o n m e n tM i c r o b i o l,２００８,７４(２４):７７１５Ｇ７７２２．D O I:１０．１１２８/A E M．００８６５Ｇ０８收稿日期:２０１７Ｇ１２Ｇ０４㊀编辑:刘岱伟(上接第４页)[４]曹仕鹏,蒋之,傅满姣．脊柱结核延误诊断及治疗困难原因分析[J]．临床误诊误治,２０１５,２８(１２):１Ｇ４．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ３４２９．２０１５．１２．００１[５]B e l l oA K,N j o k uC H．T u b e r c u l o s i s:c u r r e n t t r e n d s i nd i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t[J]．N i g e r JC l i nP r a c t,２００５,８(２):１１８Ｇ１２４．[６]Z h a n g H,W a n g J,L e i J,e ta l．P P E p r o t e i n(R v３４２５)f r o m D N As e g m e n tR D１１o f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s:a p o t e n t i a l BＧc e l l a n t i g e nu s e d f o r s e r o l o g i c a l d i a g n o s i s t od i s t i n g u i s hv a c c iＧn a t e d c o n t r o l s f r o mt u b e r c u l o s i s p a t i e n t s[J]．C l i n M i c r o b i o l I nＧf e c t,２００７,１３(２):１３９Ｇ１４５．D O I:１０．１１１１/j．１４６９Ｇ０６９１．２００６．０１５６１．x[７]王倩,罗微,屈子璐,等．结核分枝杆菌R v３４２５蛋白抗原免疫学特性的研究[J]．中国免疫学杂志,２０１７,３３(１):３１Ｇ３５．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１０００Ｇ４８４X．２０１７．０１．００６[８]A b d a l l a hAM,V e r b o o m T,H a n n e s F,e t a l．As p e c i a l s e c r e t i o n s y s t e m m e d i a t e s P P E４１t r a n s p o r t i n p a t h o g e n i cm y c o b a c t e r i a[J]．M o l e c u l a rM i c r o b i o l o g y,２００６,６２(３):６６７Ｇ６７９．D O I:１０．１１１１/ j．１３６５Ｇ２９５８．２００６．０５４０９．x[９]余晓丽,孙战强,周晨俊,等．结核分枝杆菌R v１１６８c蛋白的基因表达㊁纯化及结构分析[J]．微生物学报,２０１０,５０(７):９３１Ｇ９３６．D O I:１０．１３３４３/j．c n k i．w s x b．２０１０．０７．０１９[１０]冯英凯,王勇,黄正谷,等．蛋白芯片技术与其他４种检测方法对结核病诊断价值的比较[J]．中华肺部疾病杂志,２０１７,１０(４):４２７Ｇ４３０．D O I:１０．３８７７/c m a．j．i s s n．１６７４Ｇ６９０２．２０１７．０４．０１２[１１]宁博．结核分枝杆菌P C R检测对菌阴肺结核的诊断价值研究[J]．中国医学工程,２０１５,２３(１２):６９．[１２]蒋瑜,吴婷．结核感染T细胞斑点试验及抗结核抗体检测在结核诊断中的应用价值评价[J]．实用预防医学,２０１７,３８(１６):２２３４Ｇ２２３６．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１７．１６．０２２[１３]叶伟南,莫荣新,李少芳．三种方法检测结核分枝杆菌复合群的比较分析[J]．临床肺科杂志,２０１７,２２(１０):１９２１Ｇ１９２３．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００９Ｇ６６６３．２０１７．０１０．０４７[１４]C h o u d h a r y R K,M u k h o p a d h y a y S,C h a k h a i y a rP,e t a l．P P E a n t i g e n R v２４３０c o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i n d u c e s a s t r o n g BＧc e l l r e s p o n s e[J]．I n f e c t I mm u n,２００３,７１(８):６３３８Ｇ６３４３．D O I:１０．１１２８/I A I．７１．１１．６３３８Ｇ６３４３．２００３[１５]Z h a n g S L,Z h a o J W,S u nZ Q,e t a l．D e v e l o p m e n t a n d e v a l u aＧt i o no f an o v e lm u l t i p l e a n t i g e nE L I S Af o r s e r o d i a g n o s i s o fT uＧb e r c u l o s i s[J]．T u b e r c u l o s i s,２００９,８９(４):２７８Ｇ２８４．D O I:１０．１０１６/j．t u b e．２００９．０５．００５[１６]孙卫国,张灵霞,熊志红,等．结核分枝杆菌R v３４２５蛋白原核可溶性表达[J]．实用预防医学,２０１４,２１(１２):１４０９Ｇ１４１１．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００６Ｇ３１１０．２０１４．０１２．００１[１７]孙卫国,李邦印,王倩,等．重组结核分枝杆菌P P E１７蛋白原核可溶性表达纯化和血清学诊断研究[J]．中国预防医学杂志,２０１１,１２(１１):９１０Ｇ９１３．收稿日期:２０１８Ｇ０５Ｇ１６㊀编辑:刘岱伟０１中国人兽共患病学报２０１９,３５(１)。

结核分枝杆菌Rv3425与Rv3614c的相互作用

国国立生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）数据库中检索各蛋白的功能，筛选与Ｒｖ３４２５相互作用的蛋白，并用谷胱甘
肽一转移酶（ＧｓＴ）ｐｕｌｌｄｏｗｎ验证。结果显示，免疫共沉淀联合质谱分析筛选到１０个与Ｒｖ３４２５相互作用的蛋白，在细胞内Ｒｖ３４２５协同作用下参与肽聚糖合成途径、分枝菌酸合成途径、ＥＳＸ－１蛋白分泌系统及细菌毒力调控。ＧＳＴｐｕｌｌｄｏｗｎ验证发现Ｒｖ３６１４ｃ与Ｒｖ３４２５可体外结合。本研究证实Ｒｖ３４２５与Ｒｖ３６１４ｃ存在相互作用，Ｒｖ３４２５可能与ＥＳＸ．１蛋白分泌系统及结核分枝杆菌致病机制密切相关。关键词：结核分枝杆菌；Ｒｖ３４２５；免疫共沉淀；谷胱甘肽一转移酶ｐｕｌｌｄｏｗｎ；蛋白质相互作用
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＢＣＧ。ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｂｖＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅＲｖ３４２５ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｍｅｄｉｎＢＣＧ（ｒＢＣＧ）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＣＯ — ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－Ｈｉｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｍａｓｓｓｅｃｐｔｒｏｍｅｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘ；

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化

ｌ临床诊断提供有效的候选抗原。方法利用生物信息学分析免疫优势位点，设计不同引物，用聚合酶链反应（ｏｍｒｅ采Ｐｌｅｓｙａ
ＣａｎＲａｔｎＰＲ）ｈｉｅｃｏ，Ｃ扩增出相应基因片段，ｉ插入ｐＴ０表达载体，Ｅ３ａ转人大肠杆菌Ｂ２１Ｄ３，ＰＧ诱导表达目的蛋白，Ｉ（Ｅ）ＩＴ２亲和纯
ｓｓｎｏｐｏｉｅａｃｎｉａｅａｔｅｏＢｅｄａｎｓｓＭｅｈｄＴｈｎｉｉ，ａｄｔｒｖｄａｄｄｔｎｉｎｆｒＴｓｒｉｇｏｉ．ｇｏｔｏｓｅａｍｍｕｎｄｍｉａｔｅｉｐｓｗｅｅａａｙｅｙｍｅｎｆｏｏｎｎｐｔｅｒｌｚｄｂａｓｏｏｎｂｉｉｆｒｔｓｈｎｗｅｅａｌｆｄｂｏｎｍａｉ，ｔｅｒｍｐｉｅｙＰＣＲＴｅｓｃｏｅｎｏｃｒｅｐｎｉｇｓｔｓｏｅｅｐｅｓｎｖｃｏＥＴ０ａａｄｔａｓｏｍｅｎｏｏｃｉｈｙｗａｌｎｄｉｔｏｒｓｏｄｎｉｆｔｘｒｓｉｅｔｒｐ３ｎｎｆｒｄｉｔｅｈｏｒ
化后用Ｈ７ｖ３Ｒ免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验（ｎｙｅｉｅｍｎｓｂｎａａ，ＬＡ）ｅｚ－ｋｄｉｕｏｒｅｔｓｙＥＢ测定其免疫原性。结果ｍｌｎｍｏｓ
ＰＲ扩增的ＣＰ０、ＳＴＣＦ１报道的完全一致。三者在大肠杆菌Ｂ２（Ｅ）Ｌ１Ｄ３中融合表达的产物约为２ｋａ与预计大小相吻合。Ｎ— Ｔ２Ｄ，ｉＡ亲和纯化出目的蛋白。ＥＩＡ显示该蛋白具有较强的免疫原性。结论ＮＬＳ结

结核分枝杆菌Rv3425特异性蛋白片段与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用价值

３４９
生
物
技ＬＥＴＹＳＩＢＯＴＨＮＯＯＧＹＶ１２Ｎｏ３Ｍａ，２１ＥＲＮＩＥＣＬｏ．．ｙ０２１
ｄｉ１３６．ｎ０９０２０１３２ｏ０９９ｉ．０—０．１０．０：．￣ｓ１ｓ０２．０
ＷＵＪｉ盱ｉＹＥＪｎＪ２ＩＮＧＹｎ－ｉｇ￣Ａ０ＨｕｉＪ。ＩＹｎＵｕ－ｉ，ＪｅＡｏｇＱａｌｎ，Ｈａｉｂｏ－ｅ，Ｌ
１．Ａｉａｅｓｉｌ．ＩｓｉｔｆＭｉｒｂｏｏｙａｄＥｉｅｏｏ；Ａｃｄｍｙｏｌａｙ．ａｆｌｔｄＨｏｐｔ；ｂｎｔｕｅｏｃｏｉｌｇｎｐｄｍｉｌｇｉａｔｙａｅｆＭｉｔｒＭｅｉａｃｅｃｓｅ— ｉｄｃｌＳｉｎｅ，Ｂｉ
ＥＡ６的敏感性为３％，异性为９％；蛋白联合检测，感性提高到５％，异性为９％。论：物信息学预ＳＴ７特５２种敏７特５结生
测Ｒ３２ｖ４５的优势抗原表位，表达并纯化的ｒｖ４５－６ｒＦＩ — ＳＴＲ３２１和ＣＰＯＥＡ６在结核抗体检测中具有一定的抗原互补９７性，保持特异性的基础上可显著提高检测敏感性。在［键词］结核分枝杆菌；ｖ４５蛋白；合蛋白ＣＰ０ＥＡ６抗原性关Ｒ３２融Ｆ１一ＳＴ；

结核分枝杆菌Rv3245蛋白抗原免疫学特性的研究

３００３５０，Ｃｈｉｎａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓｔｉｃｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＲｖ３４２５ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｉｔｓｄｉａｇｎｏｓｉｓｖｌａｕｅ
［摘
要］目的：研究结核分枝杆菌Ｒｖ３４２５蛋白免疫学特性，评估其诊断应用价值及在结核致病性中的作用。方法：
将Ｒｖ３４２５基因克隆至ｐＥＴ２８ａ载体中，诱导表达Ｒｖ３４２５融合蛋白并进行纯化；利用ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析其抗原性与特异
ｐｕｉｒｉｆｅｄ；ｗｅａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙｏｆＲｖ３４２５ｂｙＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ — ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｍｅｔｈｏｄｓ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓｅｆｆｅｃｔｏｆＲｖ３４２５ｔｏｍａｃｒｏｐｈａｇｅｗａｓｄｅｔｅｃｅｄｂｙＦＣＭ（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｐｕｉｒｉｆｅｄｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ

血清学诊断在结核病中的临床应用价值

▪ 陈全等以CFP10-ESAT-6融合蛋白为抗原，用ELISA法检测豚鼠血清中抗结
核分枝杆菌抗体，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11 份BCG免疫
豚鼠血清仅1份呈阳性反应。
.
U1蛋白
▪ Mukherjee等收集结核分枝杆菌H37Rv株静脉感染C57BL/6小鼠早期(10～14d) 尿液分离到一种结核抗原，氨基酸测序鉴定后，克隆并表达相应的基因，纯化得到可溶的重组蛋白命名为U1蛋白(Urine Protein 1)，分子量大约为16.8kDa。
.
结核分枝杆菌12 种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究
摘自：阳. 幼荣等《结核分枝杆菌12 种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究》
.
血清学检测
血清学诊断的关键是寻找灵敏度高、特异性强的理想抗原。但这方面的应用似乎并不理想。对于结核病的血清学诊断技术的研发，到现在已经有100多年的历史，但至今还没有一种血清学诊断方法可以替代结核病痰涂片镜检。
Petragnani medium Purified Protein Derivative（PPD）
Lewenstein-Jensen 培养基 Dubos agar, Ogawa 培养基 Middlebrook 7H9
1990s 2000s 20XX
核酸扩增方法 ELISPOT, QuantiFERON ?????
脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原
▪ 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结核病的血清学诊断应用较广的抗原。
▪ 有关LAM抗原的应用报道很多, Antunes等用美国生产的结明(MycoDot TM) 试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为63.0%，特异性为92.4%，认为检测LAM抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。

结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性

结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性邓毛子;石春薇;王芳;付瑞玲;王春;方正明;范雄林【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2010(030)002【摘要】目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白.方法用PCR从结核分枝杆菌1137Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达.用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性.利用PCR技术鉴定fopA基因在不同分枝杆菌的分布.结果 32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化.表达Ag85A蛋白的fopA基因在结核分枝杆菌1137Rv、1-137Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达.结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度最高.结论重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性.【总页数】5页(P117-121)【作者】邓毛子;石春薇;王芳;付瑞玲;王春;方正明;范雄林【作者单位】华中科技大学同济医学院病原生物学系,湖北武汉 430030;咸宁学院基础医学院,湖北咸宁 437100;华中科技大学同济医学院病原生物学系,湖北武汉430030;华中科技大学同济医学院病原生物学系,湖北武汉 430030;华中科技大学同济医学院病原生物学系,湖北武汉 430030;华中科技大学同济医学院病原生物学系,湖北武汉 430030;华中科技大学同济医学院病原生物学系,湖北武汉 430030;华中科技大学同济医学院病原生物学系,湖北武汉 430030【正文语种】中文【中图分类】R378.91【相关文献】1.牛型结核分枝杆菌ESAT-6原核表达载体的制备和蛋白纯化 [J], 谷晨晨;李海涛;朱言柱;常彤;苗利光;刘艳环;董昕瑜;刘爱萍2.牛结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的原核表达和纯化 [J], 徐志光;许礼义;呼西旦;宋振忠;徐敏3.结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用 [J], 王晓玮;程筱雯;张焰;徐东芳;王东萍;韦薇;王庆;徐元宏4.结核分枝杆菌Rv3425蛋白的原核表达纯化及其血清学诊断价值 [J], 孙卫国;李邦印;刘艳华;张灵霞;熊志红;程小星5.结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化 [J], 王晓娜;童贻刚;刘大斌;安小平;李存;李建彬;范华昊;张文慧;张博;米志强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析陈曦;古淑香;贾红彦;李自慧;郑小静;刘忠泉;邢爱英;杜博平;张继增;张宗德【期刊名称】《结核病与胸部肿瘤》【年(卷),期】2009(000)004【摘要】目的构建结核分枝杆菌rv1837c．rv3803c基因原核表达重组质粒，进行表达、纯化，并分析其免疫原性。

方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rvrv1837c．rv3803c基因，并克隆入pTA2质粒。

测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c 重组体。

然后转化人表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），经0．4mmol／L异丙基硫代-β—D-半乳糖苷诱导1分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western—blot，鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。

经镍离子螯和氮川乙酸一组氨酸标签亲和树脂纯化，将纯化的重组蛋白分别免疫家免，取兔血清与纯化蛋白通过Western-blot方法，检测家兔血清中的抗体。

结果pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白，表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量分别占全菌蛋白质的30％及50％。

获得纯度为90％的重组蛋白。

纯化蛋白通过Western-blot鉴定证实为目的蛋白，有较强的免疫原性。

结论成功构建原核表达重组质粒pET30a （＋）：rv1837c,pET30a（＋）：rv3803c，并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白，为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。

【总页数】7页(P254-260)【作者】陈曦;古淑香;贾红彦;李自慧;郑小静;刘忠泉;邢爱英;杜博平;张继增;张宗德【作者单位】北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室【正文语种】中文【中图分类】R378.911【相关文献】1.结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定[J], 王晓闻;蔡宏;朱玉贤2.结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定 [J], 蔡宏;潘怡;汪竟;朱玉贤3.结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析 [J], 陈曦;张宗德;古淑香;贾红彦;李自慧;郑晓静;刘忠泉;邢爱英;杜博平;张继增4.结核分枝杆菌三种分泌蛋白在原核表达载体中的克隆、表达与鉴定 [J], 蔡宏;潘怡;汪竟;朱玉贤5.结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 [J], 宫强;刘思国;王牟平;王春来;彭永刚;沈国顺因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

结核分枝杆菌Rv3425-16kD融合蛋白原核表达及其刺激ATB患者IFN-γ释放水平研究

结核分枝杆菌Rv3425-16kD融合蛋白原核表达及其刺激ATB患者IFN-γ释放水平研究史阅韩;张雪莲;解宝江;贾晓炜【期刊名称】《临床肺科杂志》【年(卷),期】2024(29)6【摘要】目的原核系统表达与纯化结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)融合蛋白抗原Rv3425-16kD,检测其能否被活动性结核病(active tuberculosis, ATB)中肺结核患者和结核潜伏性感染(latent TB infection, LTBI)者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)识别,探讨作为诊断抗原鉴别活动性结核感染的可行性。

方法利用原核表达系统表达融合蛋白Rv3425-16kD并进行亲和纯化,以Western Blot法鉴定;收集结核病医学部收治的的ATB患者、LTBI者和健康人外周血,分离PBMCs,分别用Rv3425-16kD融合蛋白、早期分泌靶抗原6/培养液蛋白10(ESAT-6/CFP10)和MTB全菌裂解液刺激后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR方法检测γ-干扰素(Interferon-γ,INF-γ) mRNA 的表达,通过t检验分析刺激前后PBMCs IFN-γ mRNA的表达差异。

结果原核系统表达及纯化的Rv3425-16kD融合蛋白相对分子质量均为37kD。

健康人PBMCs刺激前,IFN-γ mRNA表达量为4.2±1.6,MTB全菌裂解液刺激后为14.7±3.5,差异具有统计学意义(P<0.001),另外两组刺激没有明显变化;ATB患者PBMCs刺激前,IFN-γ mRNA表达量为3.7±1.2,经Rv3425-16kD融合蛋白、ESAT-6/CFP10抗原多肽和H37Rv全菌裂解液分别刺激后IFN-γ mRNA表达量为:166.0±29.7、13.7±5.8和213.0±33.5,三组抗原在刺激前后IFN-γ mRNA表达量差异均具有统计学意义(P<0.001)。

结核分枝杆菌GroES蛋白表达、纯化及其生物信息学分析

结核分枝杆菌GroES蛋白表达、纯化及其生物信息学分析郭方正;魏婧;宋亚敏;袁美丽;王楚彤;李柏青;汪洪涛;许涛【期刊名称】《齐齐哈尔医学院学报》【年(卷),期】2024(45)4【摘要】目的将结核分枝杆菌H37Ra株GroES蛋白进行原核表达与纯化,并对其进行生物信息学分析。

方法通过PCR扩增GroES基因并克隆至pET28a中,测序鉴定后将pET28a-GroES转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导GroES蛋白表达,SDS-PAGE分析表达产物,镍亲和层析柱纯化重组GroES蛋白,Western blot鉴定GroES的免疫反应性。

应用ORF Finder、ProtParam、TMHMM Server 2.0、NetPhos 3.1 Server、NetNGlyc1.0 Server、SignalP 4.1 Server、BLAST、Softberry、PSORT、Vaxijen、SOPMA、SWISS-MODE、ABC-pred、IEDB、SYFPEITHI、STRING工具对GroES的结构和功能进行生物信息学预测。

结果成功构建重组pET28a-GroES重组体,用ITPG诱导后GroES在大肠杆菌以可溶性形式表达,纯化后GroES纯度达90%,Western blot证实GroES具有免疫反应性。

生物信息学显示GroES蛋白由100个氨基酸组成,分子式为C478H776N124O147S1,等电点为4.62,为亲水性蛋白,有9个磷酸化位点,无跨膜区及信号肽序列,其编码基因MRA-3458全长303bp,含1个开放阅读框;GroES二级结构中,α-螺旋占5%,β-折叠占37%,β-转角占8%,无规则卷曲占50%;预测GroES具有多种与之相互作用的蛋白质和潜在的T、B细胞表位。

结论成功表达和纯化具有免疫反应性的重组GroES蛋白,并预测了GroES结构与功能,提示GroES可作为制备结核疫苗或药物的候选蛋白,为更深入理解结核分枝杆菌的感染免疫机制奠定基础。

两种结核分枝杆菌抗原在结核病血清学诊断中应用价值的比较

两种结核分枝杆菌抗原在结核病血清学诊断中应用价值的比较阳幼荣;吴雪琼;张俊仙;梁艳;王兰【期刊名称】《临床和实验医学杂志》【年(卷),期】2014(000)017【摘要】Objective To evaluate the significance of LAM and r38KD in serodiagnosis of tuberculosis(TB),and to develop more effec-tive diagnostic methods for tuberculosis. Methods A total of 100 serum samples from patients with tuberculosis and 100 serum samples of healthy controls were detected for antibodies against these two antigens by ELISA,and the data were evaluated by SPSS software. Results The levels of anti - LAM and anti - 38KD antibodies in patients of TB group were significantly higher than those of control group( P ﹤ 0. 05),and these two antigens had some complementary effect with each other in diagnosis of tuberculosis. Conclusion The combined application of LAM and 38KD antigens may increase the specificity in diagnosis of tuberculosis,and it may be beneficial in serodiagnosis of TB.%目的：研究结核分枝杆菌脂多糖抗原（LAM）和结核分枝杆菌重组38KD 蛋白抗原（r38KD）在结核病血清学检测中的效果，探索更有价值的结核血清学诊断方法。

结核分枝杆菌休眠存活调节子蛋白Rv2029c促进大肠埃希菌生长

结核分枝杆菌休眠存活调节子蛋白Rv2029c促进大肠埃希菌生长王永祥;张本忠;吴聪;李豪杰;何文华;高小玲【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2018(015)015【摘要】目的探讨结核分枝杆菌休眠存活调节子(DosR)蛋白Rv2029c对大肠埃希菌生长的影响,以探索其生物学功能.方法根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv 基因组核酸序列,设计Rv2029c特异性引物,采用原核表达的技术构建pET30a-Rv2029c重组质粒,并导入大肠埃希菌中进行表达.通过基因测序结果 ,确定正确质粒,将质粒负载大肠埃希菌,测定大肠埃希菌模式并绘制生长曲线.结果由于缺乏营养物质和氧气,空质粒组大肠埃希菌在6 h进入平台期,而携带有pE T 30a-Rv2029c 的重组质粒能够促进大肠埃希菌突破生长界限,维持快速对数生长期长达10 h.结论结核DosR蛋白Rv2029c能够促进大肠埃希菌生长,突破其生长界限,提高细菌应对低氧、营养物质缺乏等应激环境的能力,这可能与其在低氧环境下促进细菌的糖酵解能力有关.【总页数】4页(P2221-2224)【作者】王永祥;张本忠;吴聪;李豪杰;何文华;高小玲【作者单位】兰州大学公共卫生学院 ,兰州730000;兰州大学公共卫生学院 ,兰州730000;兰州大学公共卫生学院 ,兰州730000;兰州大学公共卫生学院 ,兰州730000;兰州大学公共卫生学院 ,兰州730000;甘肃省人民医院转化医学研究所 ,兰州730000【正文语种】中文【中图分类】R446.5【相关文献】1.结核分枝杆菌Rv3618蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化及其血清学诊断 [J], 何秀云;李净;郝娟;葛林虎;赵雅贞;黄香玉;陈红兵;何珂;王艳军2.重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG休眠菌的促生长作用 [J], 郭晓雅;师长宏;史皆然;张海;赵勇;邵成3.不同生长期晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞存活的促进作用 [J], 王文军;唐罗生;杨新光4.大鼠视网膜神经节细胞存活和突起生长与可溶性混合晶状体蛋白的促进作用体外培养实验 [J], 刘康;王一;牛建军;王艳华;曾玉晓5.结核分枝杆菌休眠复苏促进因子的研究进展 [J], 丛立新;马玉杰;梁俊超;周会敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测

结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测冯晓燕;Albert W.Tam;陈坤;王国华;宋晓国;朱翠侠;张贺秋【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2006(17)6【摘要】目的:克隆38kD、ESAT-6、CFPl0和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性.方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBVIL1表达载体,在大肠杆菌HB101株中进行表达,以间接ELISA方法初步评价其抗原性.结果:获得了结核分枝杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所纯化获得的抗原具有良好的抗原性.结论:pBVIL1表达载体可以高效表达多种结核分枝杆菌抗原,38kD、ESAT-6和CFP10抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原.【总页数】3页(P865-867)【作者】冯晓燕;Albert W.Tam;陈坤;王国华;宋晓国;朱翠侠;张贺秋【作者单位】军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;Fastgen Corporation,Fosterv City,CA 94404,USA;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q786;R392.11【相关文献】1.Tamm-Horsfall蛋白片段的基因克隆、表达、纯化及抗原性鉴定 [J], 朱美财;马红雨;王红;陈涛2.结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38 kD-ESAT6-CFP10的构建与抗原性初步检测 [J], 冯晓燕;陈坤;宋晓国;王国华;朱翠侠;李惠文;韦攀健;张贺秋3.结核分枝杆菌14 000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析 [J], 杨柳;苏明权;岳乔红;程晓东;马越云;郝晓柯4.人成熟型TGF-β1基因克隆、表达纯化及抗原性的检测 [J], 龚环宇;胡国龄;谭德明;汪玲;侯珏;刘映霞5.结核分枝杆菌融合抗原Rv3914-6His的原核表达、纯化与抗原性检测 [J], 蔡家麟;潘欣;王颖;陈敏;廖万清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

结核分枝杆菌蛋白芯片检测对结核病诊断的价值

结核分枝杆菌蛋白芯片检测对结核病诊断的价值
吴艳;赵英;符生苗;蔡俊宏
【期刊名称】《中国热带医学》
【年(卷),期】2007(7)6
【摘要】目的探讨结核分枝杆菌IgG抗体的检测及其临床应用价值。

方法应用蛋白芯片识别仪分析结核病人血清中结核菌蛋白16Kda和38Kda以及脂阿拉伯甘露糖(LAM)抗体含量,同时与ELISA法进行比较,判断其敏感性、特异性和总符合率。

结果结核蛋白芯片检测的敏感性和特异性分别为68.96%、81.11%,而ELISA法检测的敏感性和特异性分别为61.81%、85.56%。

两者检测的总符率为73.90%,两种方法的敏感性差异具有显著性(χ2=4.1,P<0.05)。

结论结核蛋白芯片检测对肺结核及肺外结核病人具有较好的诊断价值,可作为结核病的血清学辅助诊断之一。

【总页数】2页(P865-866)
【关键词】结核分枝杆菌;结核蛋白芯片;ELISA法
【作者】吴艳;赵英;符生苗;蔡俊宏
【作者单位】海南省人民医院
【正文语种】中文
【中图分类】R512
【相关文献】
1.蛋白芯片检测结核分枝杆菌对肺结核病的临床诊断价值 [J], 钱东林
2.结核分枝杆菌多抗原蛋白芯片对儿童结核病的诊断价值 [J], 张津;赵顺英;迟巍;
江载芳
3.生物蛋白芯片检测结核分枝杆菌抗体对结核病的诊断价值 [J], 路宝川
4.结核蛋白芯片、结核分枝杆菌抗体胶体金法诊试剂盒检测血清抗结核分枝杆菌抗体对肺结核病的诊断价值探讨 [J], 何建;向启云;魏娇
5.结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片在结核病快速诊断中的应用 [J], 刘洋;王甦民;付育红
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

生技术通讯ｖ・ＬＥＩＴＥＲＳＩБайду номын сангаасＮＢＩＯＴＥＣＨＮ０ＬＣＧＹｌＶｏｌ・２４Ｎ。斗ｏ．・５３Ｓｅｐ．， … ２０ｌ３ｊＴＴｌ
．
６５９
研究报告
结核分枝杆菌Ｒｖ３４２５蛋白的原核表达纯化及其血清学诊
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｃ３６ｃｎ＠１６３．ｃｏｎ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｏｂｔａｉｎｐｒｏｔｅｉｎＲｖ３４２５ｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｎｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｖａｌｕｅ
ｆｏｒｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｒｖ３４２５ｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲｆｒｏｍｇｅｎｏｍｅｏｆＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７ＲｖａｎｄｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ一２８ａｖｅｃｔｏｒ．ＡｆｔｅｒｐｌａｓｍｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．ＴｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｐｕｉｆｒｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎｄＥＬＩＳＡ．Ｒｅ－ｓｕｉｔｓ：ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＲｖ３４２５ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｆｏｒｍｏｆｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ９５％ａｆｔｅｒｒｅ —
入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）进行诱导、表达后纯化，用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹和ＥＬＩＳＡ法进行抗原性初步评价。结果：在原核系统
内经ＩＰＴＧ诱导表达后，Ｒｖ３４２５蛋白主要以包涵体形式存在，经复性和镍柱层析纯化后，纯度达９５％以上；Ｗｅ８ｔｅｒｎ印
ＳＵＮＷｅｉ —Ｇｕｏ，ＬＩＢａｎｇ—Ｙｉｎ，ＬＩＵＹａｈ —Ｈｕａ，ＺＨＡＮＧＬｉｎｇ— Ｘｉａ，ＸＩＯＮＧＺｈｉ —Ｈｏｎｇ，ＣＨＥＮＧＸｉａｏ－Ｘｉｎｇ
ＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ｔｈｅ３０９ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９１，Ｃｈｉｎａ
［中图分类号］Ｑ７８；Ｒ３９２．１
［文献标识码］Ａ
［文章编号］１００９ — ０００２（２０１３）０５ — ０６５９ — ０３
ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｉｃｆａｔｉｏｎａｎｄＳｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅ — ｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＲｖ３４２５Ｐｒｏｔｅｉｎ
断价值
孙卫国，李邦印，刘艳华，张灵霞，熊志红，程小星
解放军第３０９医院结核病研究所，北京１０００９１［摘要］目的：用原核系统表达结核分枝杆菌Ｒｖ３４２５蛋白并纯化，评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法：以结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ株基因组为模板，ＰＣＲ扩增得到Ｒｖ３４２５基因序列，克隆至表达载体ｐＥＴ一２８ａ中，转
迹和ＥＬＩＳＡ结果证明重组Ｒｖ３４２５具有较强的抗原活性；用纯化的Ｒｖ３４２５蛋白做抗原，临床诊断结核病人血清，阳性
率达５０％。结论：高纯度的Ｒｖ３４２５蛋白在结核病诊断方面具有很高的应用价值，可作为结核病诊断的备选抗原。［关键词］结核分枝杆菌；Ｒｖ３４２５蛋白；原核表达；血清学诊断