薄层扫描法

薄层扫描法

一、定义?薄层扫描法(TLCＳ)又称原位定量薄层色谱扫描法（QTLC)系指用一定得波长得光照射在薄层板上,对薄层色谱中有紫外或可见吸收得斑点或经照射能激发产生荧光斑点进行扫描,将扫描得到得图谱及积分值用于药品定性定量得分析方法。?回顾薄层色谱法（TLC）

1、薄层板得制备(硅胶板,Aｌ２O3板,聚酰胺薄膜等)?

2、点样(选择合适得展开剂，在薄板底1cm处画基线,点样)

3、展开(浸入展开剂，展开到距薄板顶端１～2cm)

4、检视（在紫外光灯下观察斑点）

了解一下薄层扫描仪

薄层扫描仪得组成及主要功能

薄层色谱扫描仪有多个厂家生产,型号不同,仪器外形、光路系统及某些功能也有差异，但其基本结构及主要功能就是基本相同得。每台仪器都包括主机、数据处理及信号输出等部分。?(１)分光器及测量范围

大多数薄层扫描仪得分光器为光栅，少数为棱镜,极个别得用滤光片,其测量范围光栅为200－800nm,棱镜为２0０－２500nm。?(２)光源及检测器?光源室具有可见光源钨灯,波长范围为４０0-800,紫外光源氘灯波长范围为２00-4０0nm，荧光光源为氙灯或汞灯。操作时可通过光源选择杆来变换光源选择镜得位置;检测器一般为光电倍增管。

表７-5-2 国外几种主要专用薄层色谱扫描仪

二、ＴLCS基本原理与方法

薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。?

１、薄层吸收扫描法得基本原理?薄层吸收扫描法就是用可见光或紫外线得单色光照射展开后得薄层色谱板,测定薄层色谱斑点(简称斑点)得吸光度(A）随展开压离(L)得变化,而获得A—Ｌ成A—Ｒf曲线,即薄层色谱扫描图(简称扫描图）。?曲线上得色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在着明显得散射现象,而使斑点中物质得浓度与吸光度得关系不服从Ｂｅｅｒ定律,所以需田Kubelｋa—Ｍunk(古柏尔卡—曼克)理论来描述。该方程式就是薄层扫描法得定量分析基础。定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回归法等。

设薄板固定相得厚度为X,入射光得强度为I、，当透过厚度x得得固定相后,照射在微分薄层厚度dx上得入射光强与反射光强分别为i与j时，如左图。其入射光强得增量与反射光强得增量分别符合以下两个微分方程:

即光照射到厚度为x得薄层后,光被吸收及散射。在入射方向,光强度因为被吸收与散射而减弱;在入射得反方向,则光强度因散射而增强。解上述方程得:

在薄层扫描时,人们只就是对进入薄层与由薄层出来得光有兴趣,也即上式得极

端情况,x=０及ｘ=Ｘ时

对比两图很易发现,由于薄层固定相得散射作用使在透射法中所测得得斑点得吸光度产生正偏差,而在反射法测定时产生负偏差。这就是因为照射光被散射,降低了透射率,吸光度增加;散射光增加了反射光光强,增加了反射率,而降低了吸光度得缘故。其次,还可发现后图比前图得横座标大25倍,这说明了反射法得灵敏度（响应值)比透过法小。??１·1 Kubｅｌkａ-Munｋ曲线校直

Ｋubelｋa-Mｕnk曲线说明了薄层色谱斑点得吸光度与其浓度间呈非线性关系,该曲线就是薄层扫描法进行定量分析得理论依据。曲线处理采用两类方法:曲线校直法及计算机回归法(线性及非线性回归)。CS系列仪器采用前者,ＣＡMＡG仪器采用后者方法。?曲线校直法就是根据薄层板得散射参数ＳＸ值,将Kuｂｅｌka-Ｍunk曲线校正为直线,简化A与ＫＸ间得关系,以利于定量分析。

用曲线校正法校直Kubelkａ—Mｕnk曲线,必须巳知薄层板得ＳＸ值,Mｒck预制硅胶板得SＸ=３,Mercｋ预制氧化铝板得SX=7,Ｗako预制硅胶FM（硅胶GF25４)板得SX=７。国产预制薄层板及自制薄层板,可参考上述数据试调,而后检查

校正就是否适宜,修正SX值再校，直至Ａ—KＸ曲线成直线为止。检查方法如下图所示。图中点样量显(横坐标)常用单位为ug/点。

应用时应注意：?曲线校直法就是一种简便得薄层扫描定量校准方法,但比较粗糙,且有时难于准确知道薄层板得ＳＸ值。为了降低定量误差，应使标准品得色谱峰峰面积与待测品(供试品)得色谱峰面积尽量接近为好。

2、薄层吸收扫描法得扫描方式及条件得选择?薄层吸收扫描法得扫描条件,包括扫描方式、波长及测光方式等。扫描方式分为直线式及锯齿式扫描。扫描波长得选择至关重要，不仅关系检测灵敏度,而且关系干扰得排除等。测光方式分为透射式及反射式

2、1 扫描方式选择?(1)直线扫描

直线式扫描就是用一光带先照射在薄层板得一端,而后作直线运动至另—端。在作直线式扫描时，实际上就是光带固定,薄层板相对于光带作直线运动。

在作直线扫描时，光带得长度对扫描后所得得色诺峰峰面积影响很大,下图说明了光带越长,所得得色谱蜂面积越小,反之则峰面积越大。光带太长,检测灵敏度低,光带太短,光带只通过斑点得一部分，所得得蜂面积,不能真实反砍斑点得吸收情况。因此,正常扫描时,应使光带长度略大于斑点直径。在多斑点扫描得,光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量误差，应使标准品斑点得直径与检品斑点得直径尽量接近。样品斑点为带状时,光带长度应约为样带得２／3。

不规则斑点,用直线式扫描定量,即使光带长度适宜,定量误差仍然较大，因为所得峰面积还与扫描方向有关。

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综上所述，直线式扫描较适用于规则圆形薄层色谱斑点及条状薄层色谱斑点得定量分析。所能测定斑点得大小，以仪器得光带长度为上限。例ＣS—930薄层扫描仪,出射狭缝最大长度(高度)为6ｍm,只能测定小于6mm得斑点。在作直线式扫描叫,光带得步进距离ΔY也影响蜂面积。斑点小应选小步进距离，选择适宜,能降低定量误差。有关ＴLC及HPTＬC板得光带长度及步进距离得具体选择见表。?(2)锯齿式扫描?用截面积为正方形得光束照射薄层板,光束得运动轨迹为矩齿形。CS系列得摆动距阂最大为30mm，因此锯齿式扫描适用于直

径小于３0mm得斑点。?

直线式扫在做锯齿形扫描时，由于光束来回通过斑点，吸光度积分值比描大，重复性较好。?锯齿扫描还适用于不规则斑点得定量。虽然扫描方向不同时,所得得色谱峰形状有差别，但积分值差别较小。?机械锯齿式描仪器扫描速度慢就是其缺点，飞点扫描型仪器(如CＳ-9000型薄层扫描仪）则克服了此缺点。（3) 双校长法得优点?a、可以排除分离度不佳得两个斑点间得相互干扰,能用于分离度不佳以至于完全重叠斑点得定量分析。?b、可以排除背景污染得干扰，使基线平直。?c、可以提高灵敏度。

d、可以改变色谱峰得倒正。?这些优点得实现,主要取决于波长对得选择。

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３·定量分析方法

ＴLCS最常用得定量方法就是外标法,包括外标一点法与外标二点法。

1外标一点法?标准曲线通过原点(截距为零)时可用外标一点法定量。即只需一种浓度得对照品溶液，与供试液同板展开，分别测定其峰面积A,即C待＝A标C标／A待

2 外标二点法

该法就是ＴLCS法中主要得定量分析方法。标准曲线不通过或一种浓度原点时只能用该法定量,至少需点两种不同浓度两种点样量得对照品溶液,与供试液同

板展开,分别测定其峰面积A,用对照品求直线方程：Ａ＝Kｍ+B,代入即得

例1山楂化滞丸中熊果酸得含量测定

测定法:取重量差异项得本品3g,剪碎,精密称定,加水１０ml,放置使溶散，滤过,药渣再用水10ml洗涤,在室温干燥至松软得粉末状,在100℃烘干,连同滤纸一并至索氏提取器内，加乙醚适量，加热回流提取4h,提取液回收乙醚至干,残渣用石油醚(30~6０℃)?浸泡２次，每次５mｌ(浸泡2mｉn),倾去石油醚,残渣加适量无水乙醇－三氯甲烷(3:2)混合溶液,微热使溶解,定量转移至5mｌ容量瓶内,并稀释至刻度,摇匀，作为供试液。另取熊果酸对照品适量,精密称定,加无水乙醇制成每１ml含0、５mg得溶液。作为对照溶液,精密吸取供试液6ul及对照品溶液4ｕl 与8ul，分别交叉点于同一硅胶G板上,以环己烷-三氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(2０：5：8:０、1)展开,取出，晾干,喷以１0%硫酸乙醇溶液，在110℃加热５~7min，至斑点显色清晰，取出,在薄层板上覆盖同样大小得玻璃板，周围用胶布固定,进行薄层扫描,波长λｓ＝５35ｎm,λR=650ｎm,分别测量供试品与对照品Ａ,计算即得、本品每丸含山楂以熊果酸(C３０H48O3)计?

熊果酸高含量为有光泽得棱柱状(无水乙醇)或细毛样针状结晶（稀乙醇)，低含量为棕黄色或黄绿色粉末,具特殊得气味,就是存在于天然植物中得一种五环三萜类化合物。熔点２83~288℃、比旋光度［α]D25 +67、5°(C=1,1ｍｏl／L

氢氧化钾醇溶液中）。在15℃时,乙醇(9９%)１毫升可溶解10毫克,沸腾1毫升可溶解4５毫克。尚易溶于甲醇,丙酮，吡啶,不溶于水与石油醚

例２香连丸中盐酸小檗碱得含量测定

测定法:取本品适量,研细，取约0、２g,精密称定,置索氏提取器中,加盐酸-甲醇（1:10０)得混合液适量,加热回流提取至提取液无色,将提取液移至1００ｍｌ量瓶中，用少量上述混合液洗涤容器，洗液并入同一量瓶中,加上述混合液至刻度,摇匀,精密量取10mｌ,置５0mｌ量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀,作为供试液。另取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定，加甲醇制成每1ｍl含２０ｕg得溶液,作为对照品溶液。精密吸取供试液４uｌ、对照液2ul与6ul,分别交叉点于同一硅胶G 板上,以甲苯－乙酸乙酯－甲醇-异丙醇-水(４:2:1:１:0、2)为展开剂,在另一槽中加等体积得浓氨试液，预饱与1５mｉn后,展开，展距约1０cm，取出，晾干，进行荧光扫描,激发波长：λ=36６nｍ,测供试品荧光强度与对照品荧光强度得积分值,计算即得。本品每1含黄连以盐酸小檗碱(C20H1８CｌNO4)计。

盐酸小檗碱就是一种异喹啉生物碱。分子式[C２0H18ＮＯ4]＋。又称黄连素。存在于小檗科等4科10属得许多植物中。小檗碱从乙醚中可析出黄色针状晶体。熔点1４5℃。溶于水,难溶于苯、乙醚与氯仿。