重组人干细胞因子工艺研究
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重组人干细胞因子工艺研究
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摘要人干细胞因子(Human stem cell factor,hSCF)是一种重要的造血细胞因子,该文章在重组hSCF工程菌的基础上,通过高密度发酵培养、包涵体分离纯化、变复性、SP—Sepharose FF、Source 30RPC与Q—Sepharose FF层析等技术分离纯化出具有生物学活性的重组人干细胞因子,建立了适合大规模生产重组人干细胞因子的分离纯化工艺。
关键词组人干细胞因子包涵体复性分离与纯化生物学活性分离纯化工艺
人干细胞因子(Human stem cell factor,hSCF) 又称为肥大细胞生长因子(mast cellgro、Ⅵh factoL MGF)、kit配体(kit ligand,KL)及steel因子(steel factoL SL),为c.kit原癌基因编码受体的配体蛋白,是自1990年发现的一种重要的细胞因子。它能够刺激早期造血干细胞及祖细胞增值,是造血干细胞增值分化的关键因子【1】。hSCF能刺激造血细胞的生长、增生与分化。它可以与其它造血因子共同发挥作用,如与白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)等表现出较强的协同效应,临床上SCF可用于治疗一系列原发性或继发性的(因毒性、辐射免疫损伤造成的)以髓细胞亚群数目减少为特征的干细胞功能异常等类型的疾病【2~4】。具有广阔的应用前景和药用开发价值。
正是由于SCF具有广阔的应用前景,所以对它的需求也很大,但是其天然来源有限,成熟型可溶性SCF(SCF165)在人体或动物体内含量甚微,在血中的浓度为3.3ng/mL,故不可能从天然组织中分离纯化足够量的样品进行实验室和临床应用研究【5】。大量实验证明,人SCF的糖基化对其活性不是必需的,如此就可以用基因工程方法,使用大肠杆菌等表达体系来生产重组人SCF(rhSCF),以此来解决这个难题【6】。
国内外多家研究单位或生物制药公司已从多方面开展重组人干细胞因子的开发与研制【7~11】。目前在美国主要有两家公司(Amgen和Immunex公司)从事rhSCF的研制,其中Amgen公司采用大肠杆菌表达系统,而Immunex公司主要采用酵母表达体系。Amgen公司产品于1994年己基本完成临床I、II期研究,于1997年完成临床III期研究,并通过FDA的审批。现在rhSCF已在澳大利亚和加拿大限制性地上市。国内军事医学科学院生物工程研究所采用rhSCF制备工艺,经过rhSCF包涵体复性,DEAE阴离子交换层析吸附、浓缩,再经S-200凝胶层析和疏水层析,最后利用G-25脱盐柱得到rhSCF样品,其生产工艺采用四步柱层析,工作量大,得率相对较低。因此应加快这方面的研究,有望在不远的将来,使我国的基因工程新药产品中能够增加rhSCF新成员【12】。
1、SCF的生物学功能【5】
(1)、SCF的结构与物化性质:
天然干细胞因子是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白,共有273个氨基酸,既有N-糖基化,又有O-糖基化位点,相对分子质量为31,000-36,000,由非共价结合的两个相同亚基组成,等电点(PI)为3.8,含有5个半胱氨酸残基,形成两对二硫键(cys4-cys39和Cys43-Cysl33)。非糖基化的SCF分子量为18,000。鼠与人的SCF有83%的同源性【13】。SCF在小鼠由lO号染色体Steel位点编码,在人位于lOq22-24。SCF的两种存在形式,一种为可溶性,即SCF可被分泌到细胞外的条件培养液中;另一种为膜结合形式,两种形式均有生物学活性。鼠和人SCF对人造血细胞几乎有相等的生物学活性,但对鼠细胞,鼠SCF比人SCF生物学效应强800倍【14】。
(2)、SCF的生物学活性:
重组SCF和天然SCF有着相同生物学活性。SCF独自不能促使造血祖细胞的分化,但能够增强造血细胞的增殖潜能,可能是SCF激活最早期的多能造血干细胞,所以表现为对各种造血调控因子的协同作用【15~16】。
2、重组人干细胞因子的生产工艺
要对重组人干细胞因子(recombinant human stem cellfactor.rhSCF)的生产工艺进行研究,包括重组大肠杆菌的培养基、摇瓶培养条件和发酵罐间歇培养的发酵生产,以及目标蛋白的分离纯化。
(1)、发酵培养基
通过摇瓶发酵对用大肠杆菌(EcDfj)DH5 o/pBV220生产rhSCF的发酵培养基进行了研究。首先从几种常用的培养基中筛选出M9培养基是最适合工程菌生长和rhSCF表达的培养基,然后又采用单因子实验方法对M9培养基中的碳源和氮源进行了逐个筛选,结果表明,最适合工程菌DH5 o/pBv220生长的碳源为葡萄糖,氮源为蛋白胨和酵母粉,最后设计正交试验,对培养基配方进行了优化,确定出较适合的培养基,同时在培养基中添加了M92以加速菌体的生长。rhSCF工程菌采用B.Braun D50(容积为70 L)发酵罐发酵,所用培养基为LB培养基,在培养温度32℃、诱导温度42 ℃、pH 7.0、Po2 30%-50%等条件下进行培养,每小时取样检测A600nm,当A600nmn达12时,培养温度升至42℃诱导3 h,离心收集菌体,采用SDS.PAGE检测rhSCF的表达水平及表达形式。
(2)、rhSCF的分离纯化
①、包涵体的分离纯化:离心收集高效表达工程菌菌体,破菌缓冲液悬浮后用高压均质机进行破菌,离心收集沉淀。沉淀分别用溶液A(10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA,pH8.5)和溶液B(10 mmol/L Tris-HCl、1 retool/L EDTA、1%Tri-tion X-100,pH 8.5)进行洗涤,收集包涵体,洗涤条件为:室温下搅拌1 h,9 000 r/min离心30 min。纯化的包涵体用溶液c(50 mmol/L Tris-HCI、7 molfLGu-HCI、10 mmol/L D,Itr,pH8.5)室温下搅拌溶解3 h,9 000 r/min离心
30 min,收集上清液置于层析柜中备用。
②、包涵体复性:将蛋白变性液缓慢滴加入复性缓冲液(2 mol/L Urea、20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA,pH8.5)中,使蛋白浓度逐渐稀释到0.2 mg/mL,
室温下搅拌复性30 h,复性结束后超滤浓缩得到rhSCF,粗蛋白样品。
③、分离纯化:超滤浓缩样品用稀醋酸调节pH为4.5左右,上样于用20 mmol/L醋酸缓冲液(pH 4.5)预平衡的sP-Sepharose FF柱,分步洗脱,收集0.4 mol/L NaCl洗脱峰.将此洗脱峰稀释后用稀盐酸调节pH为2.5,上样于用10 mmol/L盐酸缓冲液(pH 2.5)平衡Source 30RPC反相柱,收集60%乙醇洗脱峰并在稀释后用磷酸氢二钠调节pH为7.0,上样于10mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)预平衡Q-Sepharose FF柱,分步洗脱,收集0.3 mol/L NaCI洗脱峰,即得到重组蛋白样品原液,除菌后样品原液于20℃保存备用。
(3)、重组蛋白的检定
①、蛋白含量测定:采用Lowry法测定,以牛血清白蛋白为对照。
②、高压液相法(HPLC)测定蛋白纯度:采用Symmetryc8,以A相(三氟醋酸一水溶液)及B相(三氟醋酸一乙氰溶液为流动相),梯度洗脱,检测波长280 nm,理论塔板数不低于2000,按归一法计算峰面积,进行纯度分析.
③、生物活性测定:采用uT-7细胞依赖珠/MTT比色法,在570/650 nm处测定OD值,采用四参数方程法计算出rhSCF比活性单位【17】。
④、重组蛋白的稳定性考察:通过此纯化工艺所得3批冻干样品,按制剂配方配制成成品考察稳定性,分别在0、3、9、12、18、24月时间点取样,测定制剂的外观、水份、生物学活性等相关指标。
结果讨论:
hSCF具有广泛的临床应用领域和价值。由于天然hSCF来源及制备有限,因此,利用基因工程和发酵技术大规模制备rh-SCF成为生物医药行业满足临床应用的必需途径。从hSCF的分子结构分析,天然表达的hSCF是一种糖基化的糖蛋白,研究表明糖基化不影响其生物学活性【18】。因此,利用原核表达宿主制备的重组hSCF具有与天然hSCF相一致的生物学活性,这为大规模制备具有生物学活性的rhSCF奠定了理论基础。
研究发现rhSCF在大肠杆菌中以包涵体形式表达,通过包涵体的分离纯化,可以除去大量宿主蛋白和碎片,提高目的蛋白在包涵体中的含量,这对蛋白质的复性纯化比较有利。在本工艺中,复性采用常规的稀释复性,复性蛋白经超滤浓缩,同时鉴于rhSCF等电点为5.5左右,将超滤浓缩样品调节pH为4.5上样于SP-Sepharose FF层析柱除去大量杂蛋白,NaCl梯度洗脱即可得到较高纯度的rhSCF。由于SP-Sepharose FF层析柱不能除去二聚体和异构体,仍需要进一步精细纯化。在酸性条件下,rhSCF相对稳定,于是本工艺中在pH 2.5条件下采用Source 30RPC反相柱,利用乙醇梯度洗脱能有效去除二聚体和异构体。乙醇梯度洗脱条件温和,成本低,回收率高。最后,利用Q-Sepharose FF层析柱有效去除乙醇,得到纯度为98%以上、具有生物学活性的rhSCF,并且各项检测指标均符合要求。研究表明,本工艺从小试到连续3批中试放大中的发酵、样品制备以及各项指标检测均非常稳定,并且设计的工艺条件操作简单易行。动物体内试验表明其具有较强的外周血干/祖细胞动员能力【19】,表明建立的大规模制备rhSCF生产工艺符合大规模生产的要求。
rhSCF是一种有重要应用前景的细胞因子,rhSCF具有多种生物医学功能以及对造血细胞的作用。在成功构建的rhSCF工程菌基础上,经发酵进而建立了一
种大规模制备rhSCF的分离纯化工艺,为rhSCF的开发应用奠定基础,rhSCF的应用领域将会不断拓宽。
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