无菌检测风险控制 (1)

无菌检测风险控制

无菌检测的风险

假阳性：结果呈阳性，但污染不是产品所带来的，而是其他方面，比如测试环境、方法、人员、操作等方面所带来的污染。这种结果带来的后果往往是企业花费大量的人力、物力和财力去进行长时间的调查，调查后却找不到污染的根本原因，整批产品遭到报废，并且法规禁止不以发现造成污染的根本原因为目的而只是重复测试的行为。

假阴性：结果呈阴性，但产品本身是存在微生物污染的，是由于微生物受到抑制或伤害没有恢复出来才没有生长。这种情况下，厂家会释放产品，导致的后果有可能是，给药后，微生物在合适的环境下大量增殖，病人遭受严重的伤害甚至危害到患者的生命。而企业则会面临产品召回，品牌受损甚至工厂关闭风险。

无菌检测环境因素

关于环境因素，主要是防止在试验过程中的外来污染对于检测过程的影响，防止假阳性的出现。尤其是针对于直接接种法和开放式薄膜过滤法的无菌检测方法，外部环境的污染问题就成为无菌试验假阳性的最大可能。因此目前封闭式薄膜过滤法应用的越来越多。即便如此，外部环境的影响仍然对于样品检测是非常大的风险。目前对于环境控制的方法主要有两个：B级下的局部A级（万级下的局部百级——2010版）操作区域，或者隔离器中进行无菌操作。如果操作正确的话，两种方式均能够给我们的实验室实现“近似”无菌的操作环境。

洁净室中进行无菌检测

对于B级下的A级（国内通常是万级下的百级）操作区域，通常是由层流台来实现的，无论是垂直层流还是水平层流都能够满足我们的无菌检验需求。但是从工作原理上看，生物安全柜并不适合进行无菌试验。应该定期对于层流台进行检测，尘埃粒子、风速、沉降菌、浮游菌等关键技术指标以保证该系统处于正常的工作状态之中。对于万级设施，应该将其等同视为生产区洁净室进行控制，给局部百级一个较好的外部环绕环境，能够更好地保证局部百级的运行。

在实验过程中，无菌的保持也非常重要，特别是防止交叉污染，人员的操作和物品的位置移动都会造成这样的情况。这就对人员的要求非常高，特别是对于“无菌意识”的提高，通常是最容易讲但是也最难培训的技能和意识。整个检测过程中一定要注意几个原则：1．物品可以从洁净的“高级别”到“低级别”转移，但是不可以从“低级别”到“高级别”转移。进入洁净室的人员必须经过无菌穿衣验证，只有有资质的人员才可以进入洁净室。

2．手作为交叉污染的媒介，应该及时定期对手套使用消毒剂进行清洁，如果有微生物污染风险较高的操作，应该及时对手套和无菌衣进行更换。

3．所有需要进入实验操作区域的物品必须在经过适当处理后才进行操作。

4．试验过程中一定要注意人的操作对于气流和待试验物品的污染。所有物品的去污染化，主要指的是物品的灭菌处理和转移方式。对于可以进行高温高压进行过度灭菌的物品，应尽量采取使用这种方式（如果有双门消毒锅可以直接从无菌室将灭菌完毕的产品取出，如果没有双门消毒锅，则需要将灭完菌的物品再次通过传递窗传入洁净室），如果该物品无法

进行高温高压过度灭菌，则尽量通过浸泡的方式对表面的微生物进行去污染处理（如西林瓶装的样品和添加剂等），如果无法进行浸泡，则应该全面地进行消毒剂的喷洒和擦拭进行外表面的清洁。对于传入传递窗的物品的外包装，应尽量选用玻璃或者不锈钢这一类的材质，尽量减少选用软袋类的材质（软袋类材质带有大量的褶皱，很难对所有的外表面进行清洁）。

隔离器中进行无菌检测

对于隔离器，它能够提供一个相对较好的操作环境，由于相对封闭的腔体，加上所有的空气进出均通过高效过滤装置，所有物品进出必须经过相应的熏蒸。不同于层流台，它对于外部环境也没有那么高的要求，对于人员也不需要像洁净室那样严格的控制。但是它所达到的无菌环境的能力要更强于层流台。当然，在隔离器中进行无菌检测需要实验人员对无菌实验有更好的计划性，例如每次实验前需要有一个实验物品的清单，防止在实验过程中发现有物品的遗漏。而隔离器本身也需要有完整的灭菌记录，需要定期的维护保养和验证试验。

洁净室/隔离器环境监控

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。

检测对象：人员，空气，设备

检测方法：浮游菌、沉降菌、表面微生物、尘埃粒子

无菌检测方法因素

当进行产品无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。对于无菌检测的方法设计应考虑到：过滤性；化学兼容性，膜的兼容性；冲洗液类型及体积；潜在抑制问题

无菌检查是根据是否有微生物在液体培养基中生长来进行判断的。培养14天后，观察培养基有否变浊。

无菌检测方法包括薄膜过滤法（开放式无菌检查法及封闭式无菌检查法）和直接接种法。

对于直接接种法，药典中有描述：取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%。实践中，有两种情况会选择直接接种法，一种情况是供试品不可过滤或经过处理后也很难过滤，从而不能应用薄膜过滤法，还有一种情况是该品种项中要求用直接接种法来进行无菌检查。除此之外都应选择薄膜过滤法。

直接接种法的主要优点是适用于不可过滤的样品；有些医疗器械的无菌检查用直接接种法会比较方便，只需将其浸没在培养基中即可。缺点是其属于开放式的操作，容器的灭菌处理，打开容器，样品打开包装，接种等方面样品、容器、培养基都与外界环境有直接接触。风险包括会有污染的风险，造成假阳性的结果；药品中或多或少都有一些抑菌的成分，如果用薄膜过滤法，那么通过滤膜的过滤作用加上后续的冲洗步骤，可以尽可能的把这些成分冲洗掉，这样截留在膜片上的微生物就能得到有效的恢复，而直接接种法做不到这一点；微生