实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告
溶菌酶实验 实验报告 第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告学院：生物科学与工程学院班级：姓名：学号：组别：第七组组员：一、实验内容：溶菌酶的提取和系列性质测定在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
二、实验原理：1蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定名称实验目的和要求：实验材料：主要仪器：主要步骤：教师签名：时间：实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
溶菌酶实验实验报告第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告学院：生物科学与工程学院班级：姓名：学号：组别：第七组组员：一、实验内容：溶菌酶的提取和系列性质测定在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
二、实验原理：1蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
溶菌酶的提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异，对其进行提取、分离和纯化，并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）将鸡蛋打破，取蛋清，加入适量的醋酸，搅拌均匀，室温下静置30分钟。
（2）用滤纸过滤混合液，收集滤液。
（3）向滤液中加入硫酸铵，使蛋白质盐析，室温下静置30分钟。
（4）用滤纸过滤沉淀，收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）向滤液中加入适量的氯化钠，使蛋白质复溶，室温下搅拌30分钟。
（2）用透析袋将溶液进行透析，去除小分子物质。
（3）将透析后的溶液进行超速离心，收集沉淀。
（4）向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），使蛋白质复溶。
（5）用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究（1）测定溶菌酶的蛋白浓度。
（2）测定溶菌酶的酶活性。
（3）测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验，成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤，成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化，得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究（1）蛋白浓度：根据比色法测定，溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
（2）酶活性：根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用，测定酶活性为100 U/mL。
（3）分子量：根据SDS-PAGE电泳结果，溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源，具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中，醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
溶酶菌的实验报告
一、 溶菌酶的提取纯化
实验日期：2012-10-18
1、 溶菌酶洗脱曲线的制作：
（2）绘制洗脱曲线：
以OD280值为纵坐标，对应中间体积值为横坐标，绘制曲线：
00.25
0.50.7511.25
1.51.7520
3
6
9
12
15
18
21
24
27
二、蛋白含量＆酶活性的测定
实验日期：2012-10-19
根据上表数据，绘制标准曲线：
标准曲线
00.10.20.30.40.50.60.70
10
20
30
40
50
60
OD595
所以直线回归方程：y=0.0101x+0.0573
5
6
（1）从上面数据得出，蛋清的蛋白浓度比提取物的高，但其活性和比活性都比提取物的低。
而且提取物的纯化倍数比较高，为5.44。
（2）酶的活力表示为特定条件下单位时间内转化底物的速度，而细菌悬液的光吸收值的减少速度可以推测酶的活性。
试验过程中，每15 s记录1 次测定管的吸光度值，在15 s 至75 s 之间测定管吸光度值以稳定速度下降，因此对于酶的活性测定，单位时间应选择为15 s 至75 s。
（3）对于这次试验，在操作上我们存在明显的不足，如下：
A．标准曲线上，有两个数据点比较偏离，可能我们测定这两个数据点的OD值时润洗操作未能做到位，导致误差的出现。
B．酶活性的测定上也同样存在一定的误差，例如：平行测3次，但每次的吹打效果不一样，o秒时的OD值不太一致，可能造成不同程度的偏差！。
溶菌酶的提纯结晶和活力测定.实验报告doc
溶菌酶的提纯结晶和活力测定姓名：学号：班级：指导老师：一、实验前言1.实验背景溶菌酶（lysozyme）是一种能够水解细胞壁成分中N- 乙酰胞壁酸与N- 乙酰葡萄糖胺之间的β- 1，4 糖苷键的酶，被广泛应用于医药、食品工业、生物工程等方面，现从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶已达到工业化生产水平。
蛋清中的溶菌酶含量越高，酶活力越强，越有利于鸡蛋的保存，因此测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工有重要的指导作用，也为蛋品质评定提供了一个重要参数。
活力测定的基本原理是用一种细菌悬液作为基质,加入待测标本后保持一定时间,如样品中含有溶菌酶则细菌被溶解,即其细胞壁不溶性多糖变成可溶性粘肤。
测定方法很多:如平皿测定法、光电比浊法、粘度测定法、分解产物测定法(因为底物往往过量,通常不用底物)、化学滴定法、分光光度法及同位素技术,其中以平皿测定法和比浊法最为常用。
溶菌酶分布很广,而且不是单独存在的,往往是和许多因子共同作用、相互协调。
同时,可以直接或间接地通过酶的分解产物而起作用。
在这里许多问题正处于摸索阶段,有些方面通过特定的实验,预测其应用。
而这些特定的实验往往对某种或某一个动物而言,还有其局限性。
未定论的问题很多,许多应用尚未大面积使于临床,但是溶菌酶必将越来越引起人们的重视,特别是其广布于人体,在医药、科研方面的作用尤为重要.(l)抗菌溶菌酶不但作用于革兰氏阳性细菌,而且它作为一种非特异性免疫,即对所有的病原微生物都有一定程度的抵抗力,没有特殊的选择性,对身体的自然防御起很大作用.如鼻粘膜,口腔中含有一些溶菌酶,临床用于治疗副鼻窦炎和龋齿;眼泪和白血球中溶菌酶含量最高,因此在干燥综合症诊断上,认为泪液溶菌酶值的下降可以提供敏感可靠的指标,并能反映泪腺受损程度;在白血病患者的尿中,含有大量溶菌酶,临床上可有效地诊断白血病。
白血球中的溶菌酶在脱颗粒过程中被排列到噬菌体内,噬菌体感染宿主(抗原)后,诱导产生溶菌酶(抗体),这种溶菌酶是噬菌体染色体组,通过细胞壁分解酶和膜多糖分解酶的作用而表现,其主要功能一是使噬菌体产生吸附作用,二是使噬菌体向宿主菌体内注入DNA,溶菌酶在噬菌体侵入宿主菌细胞和溶菌的整个过程中都起着重要作用,此溶菌酶(抗体)和补体共同作用,使某些微生物敏感,因此,溶菌酶可能和噬菌体内其他抗微生物系统有协同作用,主要作用是消化细菌,而不是杀死细菌。
药用溶菌酶提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握药用溶菌酶的提取方法。
2. 了解溶菌酶的性质及其在医药领域的应用。
3. 通过实验操作，提高实验技能和科学思维。
二、实验原理溶菌酶是一种能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，具有广谱抗菌作用。
本实验采用酶法提取药用溶菌酶，通过优化提取条件，提高溶菌酶的提取率和纯度。
三、实验材料与仪器材料：1. 鸡蛋（新鲜）2. 0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）3. 1mol/L的NaCl溶液4. 5mol/L的醋酸溶液5. 95%乙醇6. 10%的硫酸铵溶液7. 0.1%的吐温-80溶液8. 2%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液仪器：1. 研钵2. 电子天平3. 电动搅拌器4. 离心机5. 超声波清洗器6. 药用溶菌酶纯度鉴定仪7. 分光光度计四、实验步骤1. 粗提取1. 将新鲜鸡蛋打入烧杯中，加入等体积的0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0），充分搅拌。
2. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质充分溶解。
3. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗提取液。
2. 分离纯化1. 向粗提取液中加入等体积的1mol/L的NaCl溶液，充分搅拌，使蛋白质盐析。
2. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
3. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
4. 向沉淀中加入5mol/L的醋酸溶液，使蛋白质溶解。
5. 向溶液中加入95%乙醇，使蛋白质沉淀。
6. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
7. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
8. 向沉淀中加入10%的硫酸铵溶液，使蛋白质沉淀。
9. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
10. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
11. 向沉淀中加入0.1%的吐温-80溶液，使蛋白质溶解。
12. 向溶液中加入2%的PVP溶液，使蛋白质沉淀。
13. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
溶菌酶的提取纯化及纯度测定
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS（pH7.0、pH8.0、）,l mLEp管, pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/L NaOH,滴管,离心管，样品S1、S2、S-2, CM一纤维素高子交换介质., 0.02mo1/LpH8.0的PBS, 0.6mo1/LNaC1,烧杯（50mL, 250mL）、桔草芽胞杆菌过夜培养物（37℃,18h,160r/min,100/250mL）、0.02mo1/L pH8.0的PBS（测活缓 冲液,含50mmo1/LNaC1）, 0.2mo1/LpH8.0的PBS。
【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引 言】 对溶菌酶的研究始于20世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有 溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。 它广泛 存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体 液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13% )在一些植物体如卷心菜、 萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪 绿药1501班201530360127同组者：连学帆 韩家鑫 实验地点：东配302实验日期：2017年5月26日-5月27日 报告完成日期：2017年5月28日 指导老师：易 喻
【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得 到，在医学及食品商具有广泛应用。 本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取， 然 后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白， 提纯所得的溶菌酶粗品， 并且通过紫外分光光度计 检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定， 确认得到了纯化倍数较高但产率较低 的溶菌酶产品。
溶菌酶分离技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握溶菌酶的提取和分离纯化方法。
2. 了解溶菌酶的生物学特性及其应用。
3. 熟悉实验室基本操作，提高实验技能。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖结构，导致细胞壁破裂而使细菌死亡的作用。
本实验通过提取鸡蛋清中的溶菌酶，运用盐析、透析、凝胶过滤等方法对其进行分离纯化，并测定其酶活性。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 鸡蛋清- 盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、氯化钠、硫酸铜、氢氧化钠、乙醇、丙酮、乙醚等- 溶菌酶标准品- 酶活性测定试剂盒2. 仪器：- 电子天平- 恒温水浴锅- 离心机- 漏斗、滤纸、烧杯、量筒、移液管、滴定管等- 紫外分光光度计- 显微镜四、实验步骤1. 溶菌酶粗提取（1）取新鲜鸡蛋清10g，加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入10ml 0.1mol/L盐酸，调节pH至4.5。
（3）室温下搅拌30min，使溶菌酶充分溶解。
（4）加入10g硫酸铵，搅拌溶解，静置过夜。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取沉淀物，加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
（2）加入10ml 0.1mol/L氢氧化钠，调节pH至7.0。
（3）透析：将溶液置于透析袋中，放入500ml蒸馏水中，室温下透析过夜。
（4）凝胶过滤：将透析后的溶液上柱，柱材料为Sephadex G-25，洗脱液为0.05mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）。
（5）收集洗脱峰，用乙醇沉淀，室温下静置过夜。
（6）离心，收集沉淀物，加入适量蒸馏水溶解。
3. 溶菌酶酶活性测定按照酶活性测定试剂盒说明书进行操作，测定溶菌酶的酶活性。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）SDS-PAGE电泳：将分离纯化的溶菌酶样品与蛋白质marker混合，进行SDS-PAGE电泳。
（2）凝胶成像分析：用凝胶成像仪观察电泳结果，计算溶菌酶的纯度。
（3）分子量测定：将溶菌酶样品与蛋白质marker混合，进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白质marker的分子量计算溶菌酶的分子量。
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定精选全文
可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定 PPT
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安 静
通常：
•低速离心以每分钟的转数表示，如： 4000r/min。 •高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。
两者可换算或查测算图。
离心机的种类
离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
角式离心机和离心头（转子）
离子交换层析
（ion exchange chromatography，IEC）
1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素
琼脂糖 —O—CH2—CO—ON- a+ 葡聚糖
载体 电荷基团
反离子
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原 件。
2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存
3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活
原理： 根据溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中携带？电，与阴/阳
离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将 溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的。 溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性 破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟） OD600值的下降评价酶活性。 溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下， OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。 280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶 浓度，用于酶比活的评价。
Hale Waihona Puke 背景知识：酶的提取、分离纯化
初步纯化（rough fractionation） （提取）：把酶从生 物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可 能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。
溶菌酶数量测定实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的基本性质和提取方法。
2. 掌握溶菌酶数量的测定方法。
3. 了解实验误差的来源及处理方法。
二、实验原理溶菌酶是一种能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物学活性。
本实验采用比色法测定溶菌酶的数量，原理如下：在适宜的pH和温度条件下，溶菌酶可以水解细菌细胞壁中的肽聚糖，产生可溶性产物。
通过测定水解后的产物浓度，可以计算出溶菌酶的数量。
三、实验材料与仪器1. 材料：溶菌酶粗提液、细菌细胞壁提取物、缓冲液、底物、显色剂等。
2. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、离心机、试管等。
四、实验步骤1. 配制底物溶液：取一定量的细菌细胞壁提取物，加入适量的缓冲液，充分溶解后备用。
2. 溶菌酶溶液配制：取一定量的溶菌酶粗提液，加入适量的缓冲液，充分溶解后备用。
3. 设置实验组与空白组：a. 实验组：取一定量的底物溶液，加入适量的溶菌酶溶液，混匀后置于恒温水浴锅中，反应一定时间。
b. 空白组：取一定量的底物溶液，加入等量的缓冲液，混匀后置于恒温水浴锅中，反应一定时间。
4. 取出实验组和空白组溶液，加入适量的显色剂，混匀后静置一定时间。
5. 使用分光光度计测定实验组和空白组的吸光度值。
6. 根据标准曲线，计算溶菌酶的数量。
五、结果与分析1. 标准曲线绘制：以溶菌酶浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 溶菌酶数量计算：根据实验组吸光度值，从标准曲线上查得溶菌酶浓度，再根据溶菌酶溶液的稀释倍数，计算溶菌酶数量。
六、讨论1. 实验误差分析：a. 溶菌酶溶液的配制：在配制溶菌酶溶液时，应严格控制溶液的浓度，避免因浓度过高或过低而影响实验结果。
b. 反应条件：在实验过程中，应严格控制反应条件，如pH、温度等，以确保实验结果的准确性。
c. 仪器误差：分光光度计的准确度、吸光度读数的准确性等因素也会对实验结果产生影响。
2. 实验结果分析：通过本实验，我们成功测定了溶菌酶的数量，并分析了实验误差。
实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告
13
离心机操作
平衡、定温、定速、定时。
14
实验一、 溶菌酶的粗提取——略
15
酶精纯化常用技术
透析
膜分离技术
超滤
凝胶过滤（分子筛/排阻）层析 离子交换层析 疏水层析 吸附层析
柱层析技术
亲和层析
蛋白质结晶
反相层析
16
Principles of Operation for Chromatography Techniques
45
1.原理
SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合
后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因
而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白 质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋 白质分子量成正比。
10
高速离心机
6000〜 25000
超速离心机
>25000
离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
11
角式离心机和离心头（转子）
角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
12
离心管
材质：玻璃， 塑料 强度：和离 心速度相配 大小：和转 子配套 高速超速管 要加盖
实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定 （酶活力、纯度及分子量测定）
1
实验内容
1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
2
背景知识
溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质
溶菌酶实验报告
1. 学习溶菌酶的提取方法；2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术；3. 了解溶菌酶活性的测定方法；4. 熟悉实验操作及数据处理。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于动物、植物和微生物细胞中的胞壁质酶，能够特异性地水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，从而破坏细菌细胞壁，导致细菌死亡。
本实验通过提取、分离纯化溶菌酶，并测定其活性，以了解溶菌酶的性质和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 酶解缓冲液- 离心机- 超声波清洗器- 萤光分光光度计- 玻璃器皿2. 实验试剂：- 酶解缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0）- 氯化钠- 磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0）- 标准溶菌酶溶液- 破菌剂1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄，加入适量的酶解缓冲液，搅拌均匀； - 将混合液用超声波清洗器处理5分钟，使溶菌酶充分释放；- 将处理后的混合液离心（3000r/min，10分钟）；- 取上清液，即得溶菌酶粗提液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将溶菌酶粗提液加入适量的氯化钠，使蛋白质沉淀；- 将沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，调节pH至7.0；- 将溶液离心（3000r/min，10分钟）；- 取上清液，即为分离纯化的溶菌酶。
3. 溶菌酶活性的测定- 将分离纯化的溶菌酶溶液用磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度；- 准备标准溶菌酶溶液，以确定溶菌酶活性；- 取一定量的稀释后的溶菌酶溶液，加入破菌剂，观察破菌效果； - 通过比较不同浓度溶菌酶溶液的破菌效果，计算溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 超声波处理后的混合液呈现乳白色，说明溶菌酶已充分释放； - 离心后，上清液中含有溶菌酶，下清液中含有蛋白质等杂质。
2. 溶菌酶的分离纯化- 加入氯化钠后，蛋白质沉淀；- 调节pH后，蛋白质溶解，溶菌酶得到纯化。
3. 溶菌酶活性的测定- 通过比较不同浓度溶菌酶溶液的破菌效果，得出溶菌酶活性为XX U/mg。
溶菌酶的提取纯化及纯度测定
分光光度计、揺床、高速离心 机，分部收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪,高速 离心机（可用50mL离心管）,冰箱,可见光分光光度计、揺床、烧杯、玻溶菌酶是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定,干燥条件下在室温可长期保存而活 性不丧失。在自然界中广泛存在,其中以禽类蛋清中含量较高,鸡蛋中占蛋白总量 的3.5%,所以我们选择使用鸡蛋清来提取溶菌酶。鸡蛋清中溶菌酶 由18种129个気基酸残基组成的单肽链蛋白质,分子中含有4个二硫键,等电点为10.8,对 温度和酸 不敏感,在弱碱性条件下稳定。 鸡蛋清中含13%~15%的蛋自质,除溶菌酶 以外,还有其他的的蛋白质,其主要特点分别如下:
溶菌酶(1ysozyme)又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。它能水解细菌细 胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡葡糖之间的β-1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,低滲溶液中细胞在内部滲透压的作用 下胀裂开,引起细菌裂解。溶菌酶主要溶解 革兰氏阳性菌的细胞壁。
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质,又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐 剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐,溶
2、平衡
用泵将3倍于柱床体积的0.02M PBS pH8.0过柱。这一步的作用是使得柱床体 系的内外达到平衡与均一,以利后续目的蛋白的结合。
【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引 言】 对溶菌酶的研究始于20世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有 溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。 它广泛 存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体 液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13% )在一些植物体如卷心菜、 萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。
实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告共63页
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
谢谢！
Hale Waihona Puke 36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
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2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素 - + —Na 琼脂糖 —O—CH2—COO 葡聚糖
载体 电荷基团 反离子
21
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
CH2CH3
载 -O-CH2CH2N-H Cl体
CH2CH3
Diethylaminoethyl (DEAE)
阴离子交换剂
5. 酶活力及比活性计算：
U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2 C(mg/ml)=A280/13 6. 纯化回收率及纯化倍数计算 US2*V2 US1*V1 S2比活力 S1比活力
回收率＝ 纯化倍数＝
×100％
42
7. 完成下表
样品 S1 S2 体积 ml V1＝ V2＝ 蛋 白 浓 度 总蛋白 mg/ml mg 活力 u/ml 比活力 u/mg 总活力 U 回收率 提 纯 倍 数 % 100 1
10
高速离心机
6000〜 25000
超速离心机
>25000Fra bibliotek离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
11
角式离心机和离心头（转子）
角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
12
离心管
材质：玻璃， 塑料 强度：和离 心速度相配 大小：和转 子配套 高速超速管 要加盖
称为1标准单位。
2.酶的比活力：
每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位
/mg酶蛋白氮来表示；
对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。
很明显，比活力越大，酶的活力越大。
37
3.具体测定方法
分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。
Gel Filtration
Ion Exchange
Hydrophobic Interaction
Affinity
Reversed Phase
17
实验二、溶菌酶的分离纯化及酶活力 、蛋白浓度测定
目的：
1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原
件。
2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存
3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活
1.观摩 2.实验步骤 1）测定酶浓度（S-2） C(mg/ml)=A280/13 2）若填料载量为20mg/ml，计算拟纯化100mg 蛋 白需要的填料量和量取量。
34
3）装柱要点： a. 用纯水将乙醇保存液置换 b. 柱头及柱底适配器确保无气泡，可用注射器推注 赶气泡，并确保连接管路密闭无泄漏。
在标准曲线上求得分子量。
48
49
2. 分离效应
PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 不连续PAGE
3. 操作 平衡
2）洗脱:
上样 冲洗 洗脱
再生
1）上样：上样体积不十分严格。 增加溶液的离子强度 梯度洗脱法 （连续、不连续）改变溶液的pH值 3）再生：0.5-1mol/L NaCl溶液处理。
4.应用
制备纯化生物大分子
27
梯度洗脱方式
28
图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线 （a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度
44
1.原理
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳
（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel 用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量
electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS－ PAGE。 （relative molecular mass, Mr ）测定。
高度纯化（fine
fractionation） （精纯化）：除去与产 物性质相似的杂质。
纯化方案评价：酶活力、蛋白浓度、纯度
6
粗纯化（ 提取）目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。
b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，
一般采用低温下（0~10℃）操作。
提取原则
a. 相似相溶。
pI > 8.0 蛋白质带正电
pH8.0
25
2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程
- ClCl Cl-Cl -
Cl-
- ClCl Cl Cl- - Cl Cl Cl- Cl Cl- - Cl Cl Cl- - Cl ClCl
+
平衡
吸附
去吸附
低 盐
分离结束
高 盐
再生
利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來
26
溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下，
OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。
280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶 浓度，用于酶比活的评价。
19
离子交换层析
（ion exchange chromatography，IEC）
20
1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。
比色皿
PBS缓冲液/ml 细胞PBS悬液/ml 酶液S1/ml 酶液S2/ml
1
5 -
2
5 -
3
4.8 0.2
4
4.8
0.2
41
实验步骤：
4. 酶活性测定，以①管（PBS）为对照，每隔30s 测定2,3,4管的 OD600并记录
时间（s） 2号 3号 4号 0 30 60 90 120 150 180
13
离心机操作
平衡、定温、定速、定时。
14
实验一、 溶菌酶的粗提取——略
15
酶精纯化常用技术
透析
膜分离技术
超滤
凝胶过滤（分子筛/排阻）层析 离子交换层析 疏水层析 吸附层析
柱层析技术
亲和层析
蛋白质结晶
反相层析
16
Principles of Operation for Chromatography Techniques
45
1.原理
SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合
后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因
而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白 质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋 白质分子量成正比。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中
的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度 （蛋白质分子量）有关。
46
SDS-PAGE separates proteins by MW
47
蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关 系，符合下式：logMW=K-bX MW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可
29
层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、 部分收集器、梯度洗脱器。
30
层析设备
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
31
记录仪
32
现代化层析设备 ——AKTA
层析柱 XK BPG
实验2.1 层析柱的填装
制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活
3
4
溶菌酶理化性质：相对分子质量14700 Da，由 129个氨基酸残基构，pI:~10.8，最适温度为 50℃，最适pH为6～7左右。280nm的消光系数 为13.0
5
背景知识： 酶的提取、分离纯化
初步纯化（rough
fractionation） （提取）：把酶从生 物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可 能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。
纯化倍数＝
每次比活力 第一次比活力
实验2.2溶菌酶的活性测定
实验材料： 1. 枯草芽孢杆菌悬液
2. S1，S2
3. PBS等
4. 分光光度计、比色皿、计时器、离心机等
40
实验步骤：
1. 取6ml 菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀 6ml PBS重悬。
2. 测定OD600并记录（吸光度0.5~1.0，若读数过高可适当稀释） 3. 测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加 入）
23
化学原料合成 ： sephadex sepharose 载体
天然材料制成： cellulose
如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose
24
实验设计原理
离。
利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷
不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分
溶菌酶pI:~10.8
pI < 8.0 蛋白质带负电
实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定 （酶活力、纯度及分子量测定）
1
实验内容
1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
2
背景知识
溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质