胶乳凝集试验
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指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理
化性质，而得到的性质的数值曲线。是标准物质的
物理/化学属性跟仪器响应之间的数学关系。 横坐标(X)表示可以精确测量的变量（如标准溶液的 浓度），称为普通变量；
纵坐标(Y)表示仪器的响应值（测量值），如吸光度、
电极电位等，称为随机变量。
如何绘制标准曲线？
• 横坐标——各稀释度标准液的沉淀环直径 • 纵坐标——相应孔IgG浓度的对数值( log IgG )
单向免疫扩散试验 （single immunodiffusion test）
• • • • •
•
抗原——可溶性抗原 抗体——相应抗体 介质——凝胶 现象——肉眼可见的沉淀环 作用——定量
methods from clinical chemistry\standard cruve.JPG
实验原理
单向免疫扩散试验 • 将一定量抗体混匀于琼脂糖凝胶内。制 板，打孔，在凝胶孔中加入标准抗原溶 液或待测样本。 • 可溶性抗原在凝胶中向四周呈辐射状扩 散并与凝胶中的抗体发生特异性结合， 在抗原抗体比例合适处形成白色沉淀环。 • 沉淀环的大小与抗原的浓度成正相关。 以不同浓度标准抗原液制做标准曲线， 通过待测标本沉淀环大小（直径）可在 标准曲线上查出其抗原浓度。
• 液体内沉淀反应：免疫比浊测定
优点：自动化程度高； 快速、灵敏、稳定、精密； 抗原过量检测
1.透射免疫比浊法： 2.散射免疫比浊法：终点法；速率法 3.免疫胶乳比浊法：
BECKMAN COULTER IMMAGE800 临床实验方法介绍
单扩试验的应用
• 定量试验，用于检测人体内小分子物质含量：IgG、 IgA、 IgM，C3、C4，特种蛋白等。 • 灵敏度低（1.25mg/L），时间长（24h）重复性差， 目前基本被淘汰。
• 临床在用仪器多为：速率散射比浊法。 灵敏度高（ug/L），快速（几分钟），精密度 高（CV<5%），准确（抗原过量检测）
5扩 散
• 将加样完毕的凝胶板放入湿盒。
• 37 ℃，扩散24小时。
6 结果判读
• 准确测量S1-S5沉淀环的直径（单位：mm）
• 以沉淀环直径与相应标准品浓度的对数值 绘制标准曲线。 • 准确测量待测样品的沉淀环的直径，在标 准曲线上查出待测样本中IgG的浓度。
标准曲线（standard curve）：
其他介质？
• 凝胶内沉淀反应：抗原依靠物理性质在凝胶介 质中自由扩散。 • 免疫电泳技术：电泳分析+沉淀反应（电场）
优点：加速沉淀反应速度； 电场规定了抗原和（或）抗体的扩散方向； 区分蛋白质组分。 1.对流免疫电泳：电泳+双扩 2.火箭免疫电泳：电泳+单扩 3.免疫电泳： 区带电泳+双扩 4.免疫固定电泳：区带电泳+沉淀反应
实验2: 免疫沉淀技术
华西医院实验医学科临床免疫实验室 安云飞 2018.03.14
背景
絮状沉淀试验
液体内沉淀试验
沉淀反应 凝胶内沉淀试验 抗原-抗体反应 直接凝集反应 凝集反应 间接凝集反应
免疫浊度测定 单向扩散试验 双向扩散试验
间接血凝试验 胶乳凝集试验 明胶凝集试验
免疫扩散技术——IgG测定
试剂与器材
• • • • • 羊抗人IgG抗体（单扩效价1:10） 待测血清 琼脂糖 生理盐水 温度计、玻璃板、打孔器、加样器、刻度尺等
操作流程
1 2 3 4
•琼脂糖凝胶准备
•倒板、打孔
•加样
•扩散 •结果判读
5
1 琼脂凝胶准备
用生理盐水配制浓度为1.2%
（12g/L）的琼脂糖凝胶，置于 水浴中煮沸溶化至澄清。
3打 孔
使用打孔器在凝胶板上打孔：
孔径：约3.5mm 孔距：10-12mm 7孔（2排）第一排：S1，S2，S3， 第二排：S4, S5，样本（重复2孔）
10-12mm 3.5mm S1
S2
S3
S4源自文库
S5
1
2
4加 样
• 系列标准品稀释：用生理盐水将IgG标 准品（S1）按1:2、1:4、1:8、1:16稀 释成为系列标准品S2-S5。 • 待测样本用生理盐水1:2稀释。 • 每孔10μL，将标准品（S1-S5）或稀释 后样本加入孔中。 注意：做好标记
思 考 ？
• 1、单扩试验的影响因素有哪些？
• 2、单扩试验与胶乳凝集试验和免疫 比浊法相比有何异同？
• 3、单扩试验的意义？
试剂质量
（抗血清，标准抗原，凝胶）
操作规范
（制胶、倒板、 打孔、加样）
温度
单 扩
标准曲线
（稀释、测量 、绘图）
异常结果解释
其他……
单扩
自由 扩散
改进方法
加入外力？
凝胶 介质
• 注意： IgG浓度的单位： g/L 沉淀环直径的单位：mm
注意事项
倒板：
1. 严格控制加入诊断血清时的温度：56 ℃ 温度过高：抗体的免疫活性受损，失去与相应 抗原特异性结合的能力； 温度过低：凝胶开始凝结，抗体不能均匀分布 于凝胶，并且倒板也不能平整均匀。 2. 注意防止凝胶与下层玻璃板分离。 取上层玻璃板时，应用手固定U型片并推动上 层玻璃板，然后取下上层玻璃板。
2. 当沉淀环不是正圆形时，应量取最大直径和最
小直径后取二者的平均值带入计算。
3. 每批实验均应同步绘制标准曲线。
4. 样品最好做复孔，取直径的平均值带入计算。
方法评价
该方法不需要特殊设备，一般实验室
即可开展此试验；其结果经染色、干 燥后可长期保存。
х 但是，该方法操作繁琐，灵敏度低
（1.25mg/L），观察结果时间长，每 次测定需同时做标准曲线。
注意事项
打孔：
1. 孔的边缘光滑圆整，不要破裂。 2. 孔径不宜过大（约3.5mm），孔间距及孔
中心与凝胶板边缘的距离至少应有10-12mm。
注意事项
扩散：
1. 在湿盒中进行。 2. 扩散时琼脂板应保持水平，以免
沉淀环变形，影响结果判定。
注意事项
测量：
1. 测量沉淀环直径必须准确，否则明显影响结果。
（已完成）
2倒 板
• 将U型片置于两块玻璃板之间并以铁夹固定，直 立于水平台面待用。 • 取9mL已溶化的琼脂糖凝胶于试管中 • 待琼脂糖温度降至56℃时，加入羊抗人IgG诊断 血清1mL，在两支试管间颠倒混匀后迅速倒入事 先固定好的玻璃板的间隙中。 • 待凝胶板完全冷却后，先取下铁夹再小心取下 上面的玻璃板和U型片。（已完成）
化性质，而得到的性质的数值曲线。是标准物质的
物理/化学属性跟仪器响应之间的数学关系。 横坐标(X)表示可以精确测量的变量（如标准溶液的 浓度），称为普通变量；
纵坐标(Y)表示仪器的响应值（测量值），如吸光度、
电极电位等，称为随机变量。
如何绘制标准曲线？
• 横坐标——各稀释度标准液的沉淀环直径 • 纵坐标——相应孔IgG浓度的对数值( log IgG )
单向免疫扩散试验 （single immunodiffusion test）
• • • • •
•
抗原——可溶性抗原 抗体——相应抗体 介质——凝胶 现象——肉眼可见的沉淀环 作用——定量
methods from clinical chemistry\standard cruve.JPG
实验原理
单向免疫扩散试验 • 将一定量抗体混匀于琼脂糖凝胶内。制 板，打孔，在凝胶孔中加入标准抗原溶 液或待测样本。 • 可溶性抗原在凝胶中向四周呈辐射状扩 散并与凝胶中的抗体发生特异性结合， 在抗原抗体比例合适处形成白色沉淀环。 • 沉淀环的大小与抗原的浓度成正相关。 以不同浓度标准抗原液制做标准曲线， 通过待测标本沉淀环大小（直径）可在 标准曲线上查出其抗原浓度。
• 液体内沉淀反应：免疫比浊测定
优点：自动化程度高； 快速、灵敏、稳定、精密； 抗原过量检测
1.透射免疫比浊法： 2.散射免疫比浊法：终点法；速率法 3.免疫胶乳比浊法：
BECKMAN COULTER IMMAGE800 临床实验方法介绍
单扩试验的应用
• 定量试验，用于检测人体内小分子物质含量：IgG、 IgA、 IgM，C3、C4，特种蛋白等。 • 灵敏度低（1.25mg/L），时间长（24h）重复性差， 目前基本被淘汰。
• 临床在用仪器多为：速率散射比浊法。 灵敏度高（ug/L），快速（几分钟），精密度 高（CV<5%），准确（抗原过量检测）
5扩 散
• 将加样完毕的凝胶板放入湿盒。
• 37 ℃，扩散24小时。
6 结果判读
• 准确测量S1-S5沉淀环的直径（单位：mm）
• 以沉淀环直径与相应标准品浓度的对数值 绘制标准曲线。 • 准确测量待测样品的沉淀环的直径，在标 准曲线上查出待测样本中IgG的浓度。
标准曲线（standard curve）：
其他介质？
• 凝胶内沉淀反应：抗原依靠物理性质在凝胶介 质中自由扩散。 • 免疫电泳技术：电泳分析+沉淀反应（电场）
优点：加速沉淀反应速度； 电场规定了抗原和（或）抗体的扩散方向； 区分蛋白质组分。 1.对流免疫电泳：电泳+双扩 2.火箭免疫电泳：电泳+单扩 3.免疫电泳： 区带电泳+双扩 4.免疫固定电泳：区带电泳+沉淀反应
实验2: 免疫沉淀技术
华西医院实验医学科临床免疫实验室 安云飞 2018.03.14
背景
絮状沉淀试验
液体内沉淀试验
沉淀反应 凝胶内沉淀试验 抗原-抗体反应 直接凝集反应 凝集反应 间接凝集反应
免疫浊度测定 单向扩散试验 双向扩散试验
间接血凝试验 胶乳凝集试验 明胶凝集试验
免疫扩散技术——IgG测定
试剂与器材
• • • • • 羊抗人IgG抗体（单扩效价1:10） 待测血清 琼脂糖 生理盐水 温度计、玻璃板、打孔器、加样器、刻度尺等
操作流程
1 2 3 4
•琼脂糖凝胶准备
•倒板、打孔
•加样
•扩散 •结果判读
5
1 琼脂凝胶准备
用生理盐水配制浓度为1.2%
（12g/L）的琼脂糖凝胶，置于 水浴中煮沸溶化至澄清。
3打 孔
使用打孔器在凝胶板上打孔：
孔径：约3.5mm 孔距：10-12mm 7孔（2排）第一排：S1，S2，S3， 第二排：S4, S5，样本（重复2孔）
10-12mm 3.5mm S1
S2
S3
S4源自文库
S5
1
2
4加 样
• 系列标准品稀释：用生理盐水将IgG标 准品（S1）按1:2、1:4、1:8、1:16稀 释成为系列标准品S2-S5。 • 待测样本用生理盐水1:2稀释。 • 每孔10μL，将标准品（S1-S5）或稀释 后样本加入孔中。 注意：做好标记
思 考 ？
• 1、单扩试验的影响因素有哪些？
• 2、单扩试验与胶乳凝集试验和免疫 比浊法相比有何异同？
• 3、单扩试验的意义？
试剂质量
（抗血清，标准抗原，凝胶）
操作规范
（制胶、倒板、 打孔、加样）
温度
单 扩
标准曲线
（稀释、测量 、绘图）
异常结果解释
其他……
单扩
自由 扩散
改进方法
加入外力？
凝胶 介质
• 注意： IgG浓度的单位： g/L 沉淀环直径的单位：mm
注意事项
倒板：
1. 严格控制加入诊断血清时的温度：56 ℃ 温度过高：抗体的免疫活性受损，失去与相应 抗原特异性结合的能力； 温度过低：凝胶开始凝结，抗体不能均匀分布 于凝胶，并且倒板也不能平整均匀。 2. 注意防止凝胶与下层玻璃板分离。 取上层玻璃板时，应用手固定U型片并推动上 层玻璃板，然后取下上层玻璃板。
2. 当沉淀环不是正圆形时，应量取最大直径和最
小直径后取二者的平均值带入计算。
3. 每批实验均应同步绘制标准曲线。
4. 样品最好做复孔，取直径的平均值带入计算。
方法评价
该方法不需要特殊设备，一般实验室
即可开展此试验；其结果经染色、干 燥后可长期保存。
х 但是，该方法操作繁琐，灵敏度低
（1.25mg/L），观察结果时间长，每 次测定需同时做标准曲线。
注意事项
打孔：
1. 孔的边缘光滑圆整，不要破裂。 2. 孔径不宜过大（约3.5mm），孔间距及孔
中心与凝胶板边缘的距离至少应有10-12mm。
注意事项
扩散：
1. 在湿盒中进行。 2. 扩散时琼脂板应保持水平，以免
沉淀环变形，影响结果判定。
注意事项
测量：
1. 测量沉淀环直径必须准确，否则明显影响结果。
（已完成）
2倒 板
• 将U型片置于两块玻璃板之间并以铁夹固定，直 立于水平台面待用。 • 取9mL已溶化的琼脂糖凝胶于试管中 • 待琼脂糖温度降至56℃时，加入羊抗人IgG诊断 血清1mL，在两支试管间颠倒混匀后迅速倒入事 先固定好的玻璃板的间隙中。 • 待凝胶板完全冷却后，先取下铁夹再小心取下 上面的玻璃板和U型片。（已完成）