尼妥珠单抗

尼妥珠单抗注射液
Nituozhu Dankang Zhusheye
Nimotuzumab Injection
本品系由稳定转染可表达人表皮生长因子受体单克隆抗体重组质粒的小鼠骨髓瘤（NS0）细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后获得的重组人表皮生长因子受体单克隆抗体（尼妥珠单抗）制成。

不含防腐剂和抗生素。

1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具和动物等应符合“凡例”的有关要求。

2 制造
2.1 工程细胞
2.1.1 名称及来源
尼妥珠单抗的工程细胞系由编码尼妥珠单抗重链的pSV2-gpt质粒和编码轻链的pSV-hyg质粒转入NS0宿主细胞构建而成。

2.1.2细胞库建立、传代及保存
细胞库建立、传代及保存应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。

将细胞种子经无血清培养液驯化，传代、扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。

各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次。

各级细胞库的细胞应经检定合格后方可用于生产。

2.1.3主细胞库及工作细胞库的检定
应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。

2.1.
3.1 支原体检查
依法检查（附录ⅫB），应符合规定。

2.1.
3.2抗体表达量测定
细胞库的抗体表达量应不低于5 µg/ml。

2.2原液
2.2.1细胞的复苏与扩增
从工作细胞库来源的细胞复苏后，进行传代、扩增，接种细胞培养罐。

2.2.2生产用细胞培养液
生产用细胞培养液应不含任何血清和抗生素。

2.2.3细胞培养
采用经批准的工艺进行细胞培养，收集含目的产物的培养液，即为收获液。

细胞培养全过程应严格按照无菌操作。

2.2.4分离纯化
采用经批准的工艺对收获液进行纯化和病毒灭活，制得高纯度的尼妥珠单抗，除菌过滤后即为尼妥珠单抗原液。

如需存放应规定保存温度和时间。

2.2.5原液检定
按3.1 项进行。

2.3 半成品
2.3.1配制与除菌
按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。

将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品。

2.3.2半成品检定
按3.2项进行
2.4 成品
2.4.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。

2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”及附录ⅠA有关规定。

2.4.3 规格
应为经批准的规格。

50mg/瓶（10ml）。

2.4.4包装
应符合“生物制品包装规程”及附录ⅠA有关规定。

3检定
3.1 原液检定
3.1.2
照
加入
m
3.1.2.4 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
用氨基酸序列分析仪或质谱法测定，N端序列应为：
轻链：Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val。

重链：pGln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-Lys-Pro-Gly
3.1.3纯度和杂质
3.1.3.1电泳法
依法测定（附录IV C）。

用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为7.5%，上样量应不低于10 μg（考马斯亮蓝R250染色法），非还原电泳条带应与对照品的一致；还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为10%，上样量应不低于10 μg（考马斯亮
蓝R250染色法）。

经扫描仪扫描，免疫球蛋白重链和轻链含量应不低于95.0%。

3.1.3.2毛细管凝胶电泳法（CE-SDS）
依法测定（附录XXX），采用CE-SDS还原电泳法测定，免疫球蛋白重链和轻链含量应不低于90.0%，非糖基化重链应不高于5.0%；采用CE-SDS非还原电泳法测定，免疫球蛋白单体应不低于92.0%。

3.1.3.3高效液相色谱法
（1）分子排阻色谱法
依法测定（附录III B）。

色谱柱以适合分离分子量为10~500KD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂（如：TSK3000SW凝胶色谱柱或其它适宜的色谱柱）；流动相为0.1mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L氯化钠-0.01%叠氮钠缓冲液，pH6.7；检测波长为280nm。

用流动相将供试品稀释至每1ml中约含4mg，作为供试品溶液，取供试品溶液25µl注入液相色谱仪。

按面积归。

依法测定（附录II A），应不低于4.8 mg/ml。

用磷酸盐缓冲液（称取磷酸二氢钠0.45g，磷酸氢二钠1.8g，氯化钠8.6g，聚山梨酯80 0.2g，加水适量使溶解成1000ml）将供试品稀释至每1ml中约含0.5 mg，作为供试品溶液，以磷酸盐缓冲液作为空白，测定3份供试品溶液在波长280nm吸光度，计算吸光度平均值。

按下式计算供试品蛋白质含量：
C=DA/El
C为蛋白质含量（mg/ml）；
D为稀释倍数；
A为吸光度平均值；
E为消光系数（1.404ml/mg.cm）；
l为液层厚度（cm）。

3.1.5效价
3.1.5.1 生物学活性
依法测定（附录XXX），生物学活性应为标准品的50%-200%。

3.1.5.2相对结合活性
依法测定（附录XXX），相对结合活性应为标准品的80～150%。

3.1.6 细菌内毒素检查
依法检查（附录XII E），应小于1 EU/mg。

3.2 半成品检定
3.2.1蛋白质含量
按3.1.4项进行，应为4.6～5.5 mg/ml。

3.2.2 无菌试验
依法检查（附录XII A），应符合规定。

3.2.3 细菌内毒素检查
依法检查（附录XII E），应小于1 EU/mg。

3.3成品检定
3.3.1 鉴别试验
3.3.1.1 等电点
依法测定（附录ⅣD）。

供试品的等电点图谱应与对照品的一致。

3.3.1.2 相对结合活性
照3.1.5.2项进行。

与空白对照相比，供试品应有明显的相对结合活性。

3.3.2 物理检查3.3.2.1外观
应为无色澄明液体，可带轻微乳光。

3.3.2.2可见异物
依法检查（附录V B），应符合规定。

3.3.2.3 溶液的澄清度
取本品，溶液应澄清。

如显浑浊，与1号浊度标准液（附录XX）比较，不得更浓。

3.3.2.4 装量
依法测定（附录I A），应不低于标示量。

3.3.2.5 不溶性微粒
依法检查（附录V I），应符合规定。

3.3.3 化学检定
3.3.3.1 pH值
应为6.5～7.5（附录V A）。

3.3.3.2渗透压摩尔浓度
依法检查（附录Ⅴ H），应为240～360 mOsmol/kg。

3.3.3.3 聚山梨酯80含量
依法检查（附录ⅥH），应不高于0.1～0.3mg/ml。

3.3.4 纯度和杂质3.3.
4.1电泳法
按3.1.3.1项进行，非还原电泳条带应与对照品的一致，还原电泳重链和轻链含量应不低于95.0%。

3.3.
4.2毛细管凝胶电泳法（CE-SDS）
依法测定（附录XXX）），采用CE-SDS还原电泳法测定，免疫球蛋白重链和轻链含量应不低于90.0%，非糖基化重链不得高于5.0%。

采用CE-SDS非还原电泳法测定，免疫球蛋
白单体不得低于92.0%。

3.3.4.3高效液相色谱法按3.1.3.3项进行，采用分子排阻色谱法，免疫球蛋白单体含量应不低于95.0%；采用弱阳离子色谱法，供试品图谱应与对照品一致。

3.3.5蛋白质含量
按3.1.4项进行，应为4.6～5.5 mg/ml。

3.3.6 效价
3.3.6.1 生物学活性
依法测定（附录XXX），生物学相对活性应为标准品的50%-200%。

3.3.6.2相对结合活性
依法测定（附录XXX），相对结合活性应不低于标准品的60～140%。

3.3.7.无菌试验
依法检查（附录XII A），应符合规定。

3.3.8细菌内毒素检查
依法检查（附录XII E），应小于1 EU/mg。

3.3.9异常毒性检查
依法检查（附录XII F），应符合规定。

4 保存、运输及有效期
于2~8℃避光保存和运输。

自生产之日起，按批准的有效期执行。

5 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。