尼妥珠单抗注射液生物学活性测定法

附录XXX 尼妥珠单抗注射液生物学活性测定法

（H292细胞增殖抑制法）

本法系依据人肺癌淋巴结转移细胞（H292）在不同浓度尼妥珠单抗注射液作用下生长情况不同，检测尼妥珠单抗注射液的生物学活性。

试剂（1）RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养液粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。或用商品化的RPMI1640溶液。

（2）维持培养液取胎牛血清（FBS）3ml ，加RPMI 1640培养液97ml，4℃保存。

（3）完全培养液取胎牛血清（FBS）5ml ，加RPMI 1640培养液95ml，4℃保存。

（4）磷酸盐缓冲液（PBS）称取氯化钠8.0g，氯化钾0.20g，磷酸氢二钾1.44g，磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。或用商品化的PBS溶液。

（5）0.25%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）-胰酶：商品化0.25%EDTA-胰酶。

（6）显色液取商品化细胞计数试剂盒（CCK-8）溶液540μl，加维持培养液810μl。

标准溶液的制备无菌条件下，取尼妥珠单抗标准品，用维持培养液稀释至300μg/ml。用维持培养液做4倍稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。

供试品溶液的制备无菌条件下，取供试品，用维持培养液稀释至300μg/ml，用维持培养液做4倍比稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。

测定法H292细胞用完全培养液于37℃，5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞，传代24~36小时后用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，0.25%EDTA-胰酶消化并收集细胞，用完全培养液配成每1ml含有6×104~8×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃，5%二氧化碳条

件下培养。18 ～20小时后弃去细胞培养板中的完全培养液，再加入不同浓度标准品溶液或供试品溶液，每孔200μl，于37℃，5%二氧化碳条件下培养68~72小时。每孔加入显色

液30μl，混匀，于37℃5%二氧化碳条件下培养4小时后，放入酶标仪，以630nm作为参比波长，在波长450nm处测定吸光度，记录实验结果。以细胞孔中加入200μl维持培养液作为细胞对照，无细胞孔内加入200μl维持培养液作为空白对照，同法测定，记录实验结果。

采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，以标准品或待测样品浓度为横坐标，以平均吸光度值为纵坐标，计算样品和标准品的半效浓度（ED50）,按下式计算结果供试品生物学活性= 标准品ED50÷样品ED50×100%

试验有效标准：S形曲线平行假设未被否决（P值>0.05）且曲线拟合度R2应大于0.95。

附录XXX 尼妥珠单抗注射液相对结合活性测定法

本法系依据不同浓度尼妥珠单抗注射液与人肺癌H125细胞结合情况不同，用流式细胞术检测尼妥珠单抗注射液相对结合活性。

试剂（1）RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养液粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105 IU和链霉素105 IU，加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。或用商品化的RPMI1640溶液。

（2）细胞培养液取胎牛血清（FBS）10ml ，加RPMI 1640培养液90ml，4℃保存。

（3）10×磷酸盐缓冲液（PBS）取三水磷酸氢二钾19.7068g，二水磷酸二氢钠3.4328g，氯化钠14.4g，超纯水200ml溶解，经121℃、15分钟灭菌。

(4) PBS 取10×PBS100ml，用超纯水稀释到1000ml。

（5）0.25%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）-胰酶商品化0.25%EDTA-胰酶。

（6）10%叠氮钠取叠氮钠0.10g，加1ml超纯水溶解。

（7）稀释液取牛血清白蛋白0.10g，10%叠氮钠100μl，PBS10ml，混匀。

（8）1%多聚甲醛溶液取多聚甲醛5g，1mol/L氢氧化钠溶液250μl，加10×PBS 50ml，混匀，用水定容至500ml。

（9）抗人异硫氰酸荧光素 (FITC)稀释溶液取抗人FITC抗体溶液适量，用PBS进行1:20～1:30稀释。

标准品溶液的制备无菌条件下，取尼妥珠单抗标准品，用稀释液稀释至50、15、5.0、3.0、2.0、1.0、0.50、0.20和0.05μg/ml，每个稀释度做2孔。

供试品溶液的制备无菌条件下，取供试品，用稀释液稀释至50、15、5.0、3.0、2.0、1.0、0.50、0.20和0.05μg/ml，每个稀释度做2孔。

测定法H125细胞用完全培养液于37℃，5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞，传代24~36小时后用于生物学相对结合活性测定。弃去培养瓶中的培养液，0.25% EDTA-胰酶消化后，于4℃每分钟1100 转离心5分钟，弃去上清，收集细胞并计数，细胞活力（活细胞数占细胞总数的百分比）应不小于80%。用10ml PBS洗涤细胞2次后，用PBS配成每1ml含有1×107个细胞的细胞悬液。取适宜规格离心管数支，向各离心管加入20μl不同浓度标准品或供试品溶液，各个浓度做2个复孔，其中2管加入20μl稀释液作为空白对照。向含有不同浓度的标准品溶液、供试品溶液和空白对照溶液的离心管中加入25μl细胞悬液，混匀，4 ℃下保温30分钟。向每个离心管中加入700μl PBS，于4 ℃每分钟1100 转离心5分钟。小心弃去上清液，在旋涡振荡器上轻轻振荡。向每个离心管中加入20 μl 抗人FITC稀释溶液，混匀。4 ℃下保温30分钟。向每个离心管中加入700 μL PBS，于4℃每分钟1100 转离心5分钟，小心弃去上清液，在旋涡振荡器上轻轻振荡。向每个管中加入1%多聚甲醛溶液500μl。用流式细胞仪读取细胞平均荧光强度，记录测定结果。

采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，以标准品或待测样品浓度为横坐标，以平均荧光强度为纵坐标，计算样品和标准品的半效浓度（ED50）,按下式计算结果样品相对结合活性= 标准品ED50÷样品ED50×100%

试验有效标准：S形曲线平行假设未被否决（P值>0.05）且曲线拟合度R2应大于0.97。