实验四、定磷法测定核酸含量(精)
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8
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
9
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水 1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出 冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液 透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴 中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。 然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容 到刻度。
10
消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL
1 0 0 1
2 1 0 0
3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
11
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
13
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
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(1) 计算回收率：
2
一、实验原理
定磷法的原理
首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定 磷试剂测定无机磷量。反应式为：
(NH4)MoO4+H2SO4
H3PO4+12H2MoO4 Vit • C
H2MoO4+(NH4) 2SO4
H3P(Mo3O10) 4+12H2O
H3P(Mo3O10) 4
Mo2O3 • MoO3（钼蓝）
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16
思考题
1. 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 酸度对测定结果的影响。
3. 定磷法操作注意哪些操作环节?
17
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。
y 50 回收率 0.15 100% 1000
x 50 RNA总磷量( g / mL ) 1.5 回收率
(A量：
RNA质量浓度（g / mL ) （总磷量 无机磷量 DNA含量 9.9% ） 10.5 总磷量 10.5
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3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
5
2、定磷试剂：
先配制3M硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏 血酸，可在冰箱中保存。 临用时按体积比及顺序配制： 水：3M硫酸：2.5%钼酸铵：10%抗坏血 酸=2 ：1：1：1 注意：硫酸加入水中要小心，应慢慢加入
6
3、沉淀剂：
1g钼酸铵+14ml 70%过氯酸+386ml水
7
4、5M硫酸 5、30%过氧化氢 6、离心机 7、凯氏烧瓶 8、烘箱 9、分光光度计 10、核酸样品液：酵母RNA1-10 mg/ml 11、愠温水浴
每人取18支试管，按照下表平行操作：
1 标准磷溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL 0 1.5 1.5 2 0.1 1.4 1.5 3 0.2 1.3 1.5 4 0.3 1.2 1.5 5 0.4 1.1 1.5 6 0.5 1.0 1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
实验四、定磷法测定核酸含量
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
3
还原产物钼蓝在波长660nm测定 吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA 的含磷量平均为9.9%。
4
二、试剂与材料
1、标准磷溶液：
K2HPO4（105℃ 烘干至恒重）0.2195g+H2O 定容至50ml(含磷量1mg/ml),冰箱中保存 备用。 临用前稀释50倍，成为含磷量为20ug/ml。
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
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1. 样品消化（每两组或三组做一份）
吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水 1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出 冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液 透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴 中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。 然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容 到刻度。
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消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL
1 0 0 1
2 1 0 0
3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
2
1 50 混匀
2
1 50
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1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
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2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
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操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
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数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
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(1) 计算回收率：
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一、实验原理
定磷法的原理
首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定 磷试剂测定无机磷量。反应式为：
(NH4)MoO4+H2SO4
H3PO4+12H2MoO4 Vit • C
H2MoO4+(NH4) 2SO4
H3P(Mo3O10) 4+12H2O
H3P(Mo3O10) 4
Mo2O3 • MoO3（钼蓝）
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思考题
1. 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 酸度对测定结果的影响。
3. 定磷法操作注意哪些操作环节?
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实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。
y 50 回收率 0.15 100% 1000
x 50 RNA总磷量( g / mL ) 1.5 回收率
(A量：
RNA质量浓度（g / mL ) （总磷量 无机磷量 DNA含量 9.9% ） 10.5 总磷量 10.5
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3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
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2、定磷试剂：
先配制3M硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏 血酸，可在冰箱中保存。 临用时按体积比及顺序配制： 水：3M硫酸：2.5%钼酸铵：10%抗坏血 酸=2 ：1：1：1 注意：硫酸加入水中要小心，应慢慢加入
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3、沉淀剂：
1g钼酸铵+14ml 70%过氯酸+386ml水
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4、5M硫酸 5、30%过氧化氢 6、离心机 7、凯氏烧瓶 8、烘箱 9、分光光度计 10、核酸样品液：酵母RNA1-10 mg/ml 11、愠温水浴
每人取18支试管，按照下表平行操作：
1 标准磷溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL 0 1.5 1.5 2 0.1 1.4 1.5 3 0.2 1.3 1.5 4 0.3 1.2 1.5 5 0.4 1.1 1.5 6 0.5 1.0 1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
实验四、定磷法测定核酸含量
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核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
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还原产物钼蓝在波长660nm测定 吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA 的含磷量平均为9.9%。
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二、试剂与材料
1、标准磷溶液：
K2HPO4（105℃ 烘干至恒重）0.2195g+H2O 定容至50ml(含磷量1mg/ml),冰箱中保存 备用。 临用前稀释50倍，成为含磷量为20ug/ml。