医学-细胞冷冻保存技术

普通冰箱
低温冰箱
-196℃液氮罐
解冻程序
原则：快速解冻
原因：解冻缓慢时，原有冰晶溶化后，又会以新的晶核为 中 心形成更大的冰晶，称为水的重结晶现象。但采 用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤。
解冻程序：从液氮中取出冷冻管，快速放入37℃- 40℃水浴 中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（40-60s).
将含有细胞的冷冻液 分装到冷冻管中
将冷冻管投入液氮
-196℃液氮罐
解冻程序
从液氮中取出冷冻管放入冰浴中 5min，使其融冻
转移到离心管，并放入冰浴中
将已在冰浴中预冷的含20%血清的Hanks液对细胞冻存悬液稀 释。
（稀释过程要缓慢，具体过程如下：前10分钟0.2ml/min速 度滴加；接下来10分钟以0.5ml滴加；接下来的15分钟以 0.75ml/min滴加；最后30min以1ml/min滴加）
冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产
生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、
细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小
冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
在培养液中加入
血清（一般20%）
10% 甘油或 DMSO
将冷冻液加入离心管，使 细胞浓度为
2~6×106cell/ml
将冷冻液分装到冷冻管中
4℃冰箱放置30-60min----
-20 ℃冰箱放置2小时 （冷冻管放入泡沫盒或用棉花纱布包裹）-70℃冰箱放置1-2天
投入液氮罐
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内， 纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定 于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃ 的速 度，在40分钟内降至液氮表面，停30 分钟后，直接投人液氮中。
冻存培养细胞
(1)预保留细胞经消化分散后，用将其预冷却，4度
取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存 液,用吸管吹打制成细胞悬液（1- 5 ×106细胞/ml)；
冷冻保护剂降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以 免对细胞造成伤害。
(2)加入1ml细胞悬液于冻存管中，在火 焰下将安瓿封口。密封后标记冷冻细胞 名称和冷冻日期。
冷冻保护剂：DMSO、乙酰胺、丙二醇、 聚乙二醇等。
玻璃化冷冻的程序
配置冷冻液
在平衡盐溶液（Hanks）中加 20.5%DMSO(w/v) 15.5%乙酰胺(w/v ) 、10%丙二醇和 10%聚乙二醇。（以单核细胞为例）
取旺盛生长的细胞，消化后用离心 管离心回收细胞，并将离心管置于 冰浴中
将预冷的冷冻液缓慢地滴加到离心管中，使细 胞浓度为1-1.5×106cell/ml。 （滴加的速度先慢后快，具体过程如下:前3分 钟以0.3ml/min滴加；后5分钟以0.6ml/min滴加； 余下的以0.75ml/min滴加）
玻璃化冷冻
原则：快速冷冻
原因：从理论上讲，只要获得足够快的降温速度，任何 液体都可以进入玻璃化状态。例如：要是纯水进 入玻璃化状态，降温速度需高达 1010 ℃/s，以现 在的条件没办法达到。
解决办法：通过添加高浓度的冷冻保护剂，
可以显著降低形成玻璃化所要求的降温速 度。一般冷冻保护剂的浓度为40%-60%。
解决办法：冷冻保护剂的应用
在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。 原理：1.常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护
剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点 2.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少
细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时， 促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀。
根据细胞冷冻液在在冻结后是否形成冰晶，低温 冷冻பைடு நூலகம்存细胞可分为：
1．非玻璃化冷冻
细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水形成冰晶。
2．玻璃化冷冻
细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水不形成冰 晶，而是形成玻璃态。
非玻璃化冷冻
原则：缓慢冷冻 原因：当温度降低到冰点以下时，细胞内外的水分就会
形成冰晶。细胞内形成的冰晶会造成细胞膜和细 胞器的损伤。这种损伤称为细胞内冰晶损伤。
3.稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。
在培养液中添加的保护剂：
二甲亚砜（Dimeethylsulfoide,DMSO）， 甘油,可使细胞免受低温冰晶形成、及渗透压
改变而导致的物理损伤。
预先配制冻存保护液： 含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养
液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；
可用带有18G针头注射器进行分装，如剂量过大， 保护剂对细胞渗透作用不匀，冷冻效果不好。
(3)加保护剂的细胞悬液经缓慢冷冻， 结冰产生在细胞外(对细胞没有损伤)。 如果要长期保存，可以使用液氮罐，
(4)冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。 温度达-150~-190 ℃ ，细胞几乎处在停止 状态。
细胞外的水形成冰晶后，使得未结冰的溶液中的 电解质的浓度升高，细胞在这种高浓度的溶质中 时间过长，会使细胞膜上的脂质受到损害，细胞 膜破裂，这种损害称之为溶质损伤。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，
细胞内不致产生大的冰晶，从而减少细胞 内冰晶对细胞的损伤；相反，结晶很大， 大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破 裂。
冷冻时带手套操作，以免冻伤。
慢冻程序
标准程序： 当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min 当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
在没有程序控制冻存器设备的条件下,
缓慢冷冻的简化程序
配置冷冻保护液
取旺盛生长的细胞,消化后 用离心管离心回收细胞
动物细胞培养的方法 之 细胞冷冻保存技术
细胞的低温保存
细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与 细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减 少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。
目前，动物细胞一般保存于液氮中 （-196℃）。
一般在原代或传代2－10次内即 大量冻存，作为原种（stock cells）， 取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻 存，这样可保证长期使用和延缓衰 老。