MEPHyperCel疏水电荷诱导层析-改变传统疏水层析

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MEP HyperCel纯化单抗

直接从料液中纯化单抗 对低表达浓度的物料也十分有效 可以替代亲合层析Protein A, 使工艺更经济 也可以有效的去除多聚体
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用MEP HyperCel直接从细胞培养液中纯化Mab
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1903: 羟基磷灰石一类混合模式层析的介质
M.S. Tswett
Ca10(PO4)6(OH)2 氨基

典型离子交换
羧基

金属亲合 (典型的螯合)被离子交换和分子筛调节 比离子交换的结合力强15 – 60倍
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Purity and Yield 97%
Residence time: 3.5 to 4.6 minutes
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MEP HyperCel
改进单抗纯化平台的机会
有可能把柱层析步骤从3步减少到2步 替代Protein A 的捕获步骤，或在其后使用混合层析方法 用高流速的膜层析技术进行精细纯化(DNA, HCP 的去除).
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混合模式层析作为传统HIC的替代
各种不同的案例中发现

与传统的HIC相比较低的盐浓度下完成结合 降低成本，用有利环保的盐 在稀释的缓冲液或合适的电导缓冲液中回收产品 通过pH和盐浓度来调节层析条件 与传统的HIC相比更高的产品回收率和更高的载量
C. Cabanne, J. Pezzini, G. Joucla, A. Hocquellet, C. Barbot, M. Noubhani,
W. Dieryck, P. Costaglioli, B. Garbay and X. Santarelli. EA4135, ESTBB, Université Victor Segalen Bordeaux 2, France Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 4451–4456
1. 2.
Low, D et al., Journal of Chromatography . B 848 (2007) 48-63 Chen, J et al. Journal of Chromatography A, 1217, Issue 2, ( 2010) 216-224
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洗脱酸性蛋白 洗脱疏水蛋白
酸性/疏水 中性蛋白
洗脱碱性蛋白
洗脱亲水蛋白
碱性/亲水
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MEP，HEA和PPA HyperCel 的应用
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混合机制层析MEP，HEA和PPA HyperCel 的应用
替代传统的疏水层析的无盐/低盐的方法，用于蛋白质的
Optimized elution step at pH 5.0 leads to IgG Purity 97% and yield of 93% (albumin eluted at pH 5.5 in the presence of 0.5 M NaCl)
优化后洗脱步骤，pH5.0洗脱目标抗体的 纯度97%,收率93%(白蛋白在pH5.5及含 0.5M Nacl的溶液中冲洗下来）
纯度>95% , 回收率 75 – 116%
较传统HIC更丰富的洗脱手段！洗脱不依赖有机溶媒
Courtesy of Dr. Andrew Lees, Fina Biosolutions, Rockville, MD
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Load
pH 3 Strip
No Am2SO4
MEP HyperCel™ 填料直接捕获单抗
Mode Capture: HCIC on MEP HyperCel
Eluate Fraction or Load
HCP in load (ng/mg) HCP in eluate (ng/mg) DNA in load (pg/mg) DNA in eluate (pg/mg) Purity (% monomer in eluate) Step Recovery (%)
MW Markers
AU
pH
pH 5.2 Elution
混合机制层析替代亲和层析
New challenging chromatographic method for the
purification of recombinant proteins fused with maltose-binding protein (MBP) in E. coli 用新的层析方法分离在大肠中表达的MBP重组融合蛋白
kDa
AU
IgG Abs. 280 nm Conductivity pH
L
75 50
25 27 30 35 40 Vol. (L)
FT
W
E1
E2
E3
Column: Equil / Wash Load Flow rate
: 5.0 cm ID x 17.5 cm H (V = 343 ml) : PBS pH 7.4 : 28 Liters (1200 mg)) : 230 cm/h (loading) to 300 cm/h (wash + elution)
捕获或中度纯化（重组融合蛋白的纯化） 单抗或多抗的捕获或中度纯化步骤（抗体片段的纯化）， 同时用有效的办法减少或去除多聚体及错误折叠物 在单抗纯化中污染物（HCP和DNA）的去除 重组蛋白物料中内毒素的去除
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混合疏水层析特点-纯化胞内金属酶
PEI-Clarified Supernatant from 100 L Fermentation (~4 g/L) Applied to 15 L Column of MEP HyperCel
Filtration. Separation. Solution. SM
疏水电荷诱导层析意味什么？
疏水电荷诱导层析是相对最近兴起的层析分离技术，因为特有的选
择性和可放大特性被行业越来越多的接受
MEP HyperCel介质的操作原理是疏水电荷诱导，基于合成配基的双
模式pH依赖行为
4-MEP配基在中性条件下不带电荷疏水结合目标分子，在流动相
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混合模式层析---省盐

I2004 at the SGM (Society for General Microbiology), Dr. Jim Davies, at Lonza Biologics, Slough, UK,
在他的报告中通过有趣的计算显示了在大规模层析中少用
Adsorption
Desorption
+
+ + + +
+
+
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Pall HyperCel 混合机制介质家族
纯化单抗和重组蛋白 是HIC的替代方法，不需加盐或加少量盐
MEP
HypeΒιβλιοθήκη BaiduCel
PPA
HyperCel
CH2-CH2-CH2-
HEA
HyperCel
(物料中含有>15%牛血清白蛋白）
mAU
IgG
Abs. 280 nm Conductivity pH
L
E
3000
Alb.
2000
HC
1000
LC
A
0
0
50
100
150
200
250
300
ml
Volume
FT
W
E1
E2
E3
E4
Reg
MEP HyperCel
Prot A (Réf.)
Equilibration/ Wash : PBS pH 7.4 Elution : E1 : 100 mM Na Ac pH 5.5, NaCl 0.5 M E2 : 50 mM Na Ac pH 5.0 E3; E4 : 50 mM Na Ac pH 4.0; 3.0 Flow rate : 80 cm/h (Residence time = 7.5 min.)
CH2-(CH2)4-CH3 50-84 µeq/mL pKa~8 己胺基
80-125 µeq/mL pKa4.8 4甲基嘧啶
58-80 µeq/mL pKa~8 苯丙胺基
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在MEP HyperCel 上优化洗脱
pH电荷-疏水相互作用的特点
pH 5.5 pH 5.2 pH 4.9 pH 4.6 pH 4.3 pH 4.0 pH 3.0
Courtesy of S.Allen, ABBOTT Diagnostics Division, IL, USA and S. Chaudoreille, Pall Applications R&D Group, Cergy (F)
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用MEP直接从未浓缩的细胞培养液（ 0.04 mg/mL）中捕获Mab IgG1
Flowthru (Load+ Wash) pH 6.4 Wash
3.0 2.5
- 12
- 10 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
150 200 250 300 350 400 450 500 550 L
-8
-6
-4
Target Protein
Sample Load
pH 7.2, contains 0.5 M Am2SO4
层析介质的新选择
混合模式层析-MEP，HEA & PPA
Jun23，Shanghai
Filtration. Separation. Solution. SM
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降低pH的条件下诱导电荷的产生洗脱结合蛋白
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传统疏水作用层析
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混合模式疏水电荷诱导层析（HCIC）
在吸附pH下配基不带电荷 不需要加盐或仅加少量的盐即能促进吸附 解离是在降低流动相pH的条件下进行的
1974: 以染料为配基的层析介质
染料与NAD 或 NADP 类似
物的特异立体识别 静电作用 疏水作用 电子交换 Pall product: Blue Trisacryl® （纯化IFN或血液制品如转铁 蛋白和血液类似物）
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MEP, HEA, PPA HyperCel™ 混合机制层析介质
Post Load Wash, pH 7.2
pH 6.4 Wash
50 mM MES
pH 5.2 Elution
50 mM acetate
pH 3.0 Strip
50 mM citrate
Equilibration & Initial Post-Load Wash: 25 mM Na phosphate, 0.5 M Am2SO4, pH 7.2
盐的好处 常规的2m内径的柱子，如果柱高在25cm，相当于820L填 料 疏水层析常用的盐为1M硫酸铵
传统的疏水层析，此工艺需要超过1吨的盐 在这种模式下，如果盐浓度仅从1.0M降到0.9M将节省800L
缓冲液，超过100公斤的盐 如果每年做40批，就意味这节省缓冲液> 30m3 及 > 4 吨盐
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混合机制层析需要不断优化达到特有的结果
如果你想得到你之前没有得到的东西
， 你就得尝试你之前没有做过的事情
Arthur Andrews
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混合模式层析
利用多种不同的蛋白配基和分子之间的相互作用吸附目标
产物或杂质 在传统的层析方法（IEX，HIC）失败或成本较高（亲合 ）的时候，混合模式层析是另外一种可能的选择， 可用 于捕获，或中度/精细纯化 配基的形式多样---合成的， 羟基磷灰石的，染料和仿生 态的配基 越来越多的获得行业的认可