淋巴细胞分离液

使用美国Mediatech公司的cellgro淋巴细胞分离液，可显著提高分离率,分离层间隔清晰。货号：25-072-CV

Lymphocyte Separation Medium(淋巴细胞分离液）

Density(密度) = 1.077-1.080 g/mL at 20ºC

【分离目的】

方便在人体外对机体各种免疫细胞分别作鉴定，计数或功能测定。

淋巴细胞分离以后可以做淋巴细胞抗原片制备，E花环试验，淋巴细胞转化试验，淋巴细胞培养（需无菌操作）

【分离原理】

人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低，根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。此次实验采用的1就是密度梯度离心法。其原理是：人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。

【材料】

1、肝素抗凝管，普通管（负压），采血针，血清收集管

2、淋巴细胞分离液(比重1.077– 1.080 g/mL）。

3、无Ca++、Mg++、Hank's 液

4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。

5置于冰箱的冷丙酮（固定细胞，保持细胞的完整性）

【方法】

1．采静脉血2ml加入肝素抗凝管（或枸橼酸钠），3ml加入普通管。

2．普通管斜面放置30MIN，此时可分离淋巴细胞。用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用玻璃棒），2000rPm离心20分钟，用毛细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中，于4℃冰箱保存备用，用于以后的ELISA实验，对流免疫电泳实验和伤寒试管凝集实验，溶血反应，免疫比浊测定补体C3或C4等等。

（剥离时也可用毛细吸管轻轻剥离）

3．趁普通管放置30MIN时，将装有静脉血2ml加入肝素抗凝管（或枸橼酸钠）轻轻摇动使血液与抗凝剂混匀，出现凝集不能继续实验。5min后加入Hank's 液2ml，手动轻轻摇匀。

4．用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢加至另一含2ml淋巴细胞分离液

液面上，注意保持两种液体界面清晰。

5．将试管平衡后置水平式离心机，2000rpm离心10min。

6．用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内。

7．加入Hank's 液5ml，手动旋转试管使液体混匀，2000rpm离心10min，弃上清，沉淀即主要为淋巴细胞（或单位个核细胞）。

备注：如做淋巴细胞转化或其它培养，所用试剂、器材应是无菌的。Hank's 液为缓冲等渗液，类似营养液，保持细胞活性及完整性，可抵抗轻微的酸碱变化。

【难点】

1．将抗凝血与Hank's 液的混合液加入淋巴细胞分离液时，必须保持两种液体界面清晰。

2．用毛细吸管吸取淋巴细胞层时，要掌握好力度，在细胞层上作各个方向的吸取，勿吸到其它层的液体或细胞，吸取时勿使各层细胞相混。

离心示意图如下

上海科页仪器科技有限公司