厌氧芽胞梭菌标本的制作

起到积极推动作用，能够弥补护理实验员的不足。需要注意的是：实验员助理一定是责任心强且学习认真的护生，工作以不影响护生学业为重；实验员要与实验员助理加强沟通与合作，要给予护生表现和锻炼的机会，但不能不管不问，完全依赖实验员助理。护生担任实验员助理，要扬长避短，发挥助理的重要作用，对护理实验室的管理和发展起到积极作用。

参考文献：

[1]张永利.护理实验教师在教学改革中的角色与功能[J].山西职工医学院学报，2007，17（1）：80.

[2]文建国，阮湘云，高单飞，等.“实验员助理制”的实践与认识[J].职业时空，2007，（2）：22~23.蒉

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关键词：厌氧芽胞梭菌；分离培养；实验教学中图分类号：

G424.31文献标识码：B

文章编号：1671-1246（2011）03-0096-02

厌氧芽胞梭菌由于来源困难，临床标本较少，为此，我们从土壤中分离厌氧芽胞梭菌中的破伤风芽胞梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌，制备菌种、芽胞和荚膜标本片，用于临床检验专业的厌氧芽胞梭菌培养实验及其他专业芽胞和荚膜特殊结构形态观察实验，取得了良好的实验教学效果，其分离制备过程如下。

1材料和方法1.1仪器及材料

电热恒温培养箱、电热恒温水浴箱、水浴锅、电炉、庖肉培养基、血平培养基、普通琼脂平板培养基、焦性没食子酸、10%氢氧化钠溶液、纱布、石蜡、无菌毛细滴管、注射器、载玻片、染色液、中性树胶、盖玻片、标本盒、小白鼠等。1.2方法

1.2.1接种标本增菌培养取10支庖肉培养基管放入水浴锅中煮沸20分钟，

以除去培养基管内的氧气；把庖肉培养基上层的石蜡在酒精灯上烤化，分别将一豆粒大小的土块（花池中的土块更好）放入培养基管内摇匀；将培养基放入80℃水浴箱内20分钟，以除去土壤中的杂菌；取出培养管并放入37℃培养箱内24～48小时。

1.2.2分离培养取出庖肉培养基，可见培养管变浑浊，管底肉渣可能部分被消化或变色，产生气体，有腐败恶臭味。选用肉汤轻度浑浊，肉渣部分消化呈微黑色，并产生少量气体，有腐败恶臭味的培养管内的培养物分离破伤风芽胞梭菌；选用肉汤浑浊，肉渣未被消化，但变为粉红色，产生大量气体，将培养管上层的石蜡冲开的培养管内的培养物分离产气荚膜梭菌；选用肉汤浑浊，肉渣消化变黑色，产生气体，有腐败恶臭味的培养管内的培养物分离肉毒梭菌。将以上培养物分别分离划线接种于血

平板培养基和普通平板培养基上，于平皿盖外部中央放2层纱布，中间包夹1g 焦性没食子酸，加10%氢氧化钠溶液1ml 于纱布上，迅速将接种好的平板培养基反转扣在纱布上（纱布直径应小于培养基，且不能与培养基表面接触），并用熔化的石蜡封固外周，放37℃培养箱厌氧培养24～48小时，或直接把接种后的平板培养基直接放入37℃厌氧培养箱或厌氧罐中培养。1.2.3菌种鉴定（1）破伤风芽胞梭菌的鉴定。破伤风芽胞梭菌在普通培养基上，形成不规则的圆形，中心实周边松似羽毛细丝，边缘呈锯齿状的扁平菌落（在血平板上易呈迁徙状生长，不易获得单个菌落，应提高琼脂的浓度）。涂片革兰氏染色，油镜观察可见革兰阳性细长杆菌，一般为（2～3）μm ×（0.3～0.5）μm ，芽胞位于菌体的一端，圆形，大于菌体，似鼓槌状。生化反应不分解糖类，能液化明胶，产生硫化氢，大多数菌株吲哚实验阳性[1]。（2）产气荚膜梭菌的鉴定。产气荚膜梭菌在血平板上形成2～4mm 、圆形、凸起、表面光滑、灰白色、不透明、边缘整齐的菌落，大多数菌株的菌落近周有完全溶血环，其外又有较宽的不完全溶血环，形成双层溶血。取典型菌落做革兰染色油镜观察，可见两端钝圆，大小为（1～1.5）μm ×（3～5）μm 的革兰阳性粗大杆菌，单个或成双存在，可见椭圆形芽胞形位于菌体中央或次极端，直径小于菌体的宽度。生化反应，

本菌能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖产酸产气，不分解甘露醇，做汹涌发酵实验6小时出现明显的阳性反应[2]。

（3）肉毒梭菌的鉴定。肉毒梭菌在血平板培养24小时，可形成2～4mm 白色粗糙的有透明溶血环的菌落，取典型菌落进行革兰染色油镜观察，可见革兰阳性粗短杆菌，两端钝圆，大小为（1～1.2）μm ×（4～6）μm ，单独或成双排列，有时可成短链状排列。芽胞呈椭圆形，

位于菌体次极端，宽于菌体，使菌体呈汤匙状或网球拍状。生化反应，本菌分解葡萄糖和麦芽糖产酸产气，不发酵乳糖，液化明胶，产生H 2S ，但不产生吲哚[2]。

1.2.4纯培养及菌种保存分别将鉴定后的菌种转种于另一血平板培养基，用上述方法置37℃厌氧培养24～48小时，再分别

厌氧芽胞梭菌标本的制作

包东武，李建华

（南阳医学高等专科学校，河南南阳473000）

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转种庖肉培养基各2支，放入37℃培养箱18小时，取出做菌种，放4℃冰箱保存备用。

1.2.5芽胞标本片的制备（1）破伤风梭菌芽胞标本片的制备。将破伤风梭菌接种于庖肉培养基中，放37℃培养箱培养24～48小时；取出观察培养管变轻度浑浊，用无菌毛细吸管滴加菌液1滴于洁净玻片上，用接种环涂匀，干燥固定；用片夹夹住玻片的一端，滴加石炭酸复红液（抗酸染色第一液）3滴左右，盖满涂膜，并以弱火微加热使染液出现微汽即可，且勿煮沸烧干，染液将干时，应随时添加，持续染色3～5分钟，待标本片冷却后水冲洗；加95%酒精脱色2分钟，水冲洗；加碱性美兰液（抗酸染色第三液）复染1分钟，水冲洗；吸水后油镜观察，可见破伤风梭菌菌体被染成蓝色，芽胞被染成红色，圆形，位于菌体的极端，膨大，似鼓槌状。用此法大批制片，染色后加盖片用中性树胶封固，晾干后贴标签长期保存使用。（2）产气荚膜梭菌芽胞标本片的制备。将产气荚膜梭菌接种于不含糖的庖肉培养基中，置37℃培养箱24小时；取出观察培养管变浑浊，涂片芽胞染色（同破伤风芽胞梭菌芽胞染色）；油镜观察，可见产气荚膜梭菌芽胞被染成红色，卵圆形，位于菌体的中央或次极端，不膨大，菌体染成蓝色。用此法大批制片，长期保存使用。（3）肉毒梭菌芽胞标本片的制备。将肉毒梭菌接种于庖肉培养基中，放37℃培养箱24小时；取出观察培养管变浑浊，涂片芽胞染色（同破伤风芽胞梭菌的芽胞染色）；油镜观察，可见肉毒梭菌菌体被染成蓝色，芽胞被染成红色，卵圆形，位于菌体的次极端，膨大，似网球拍状。用此法大批制片，长期保存使用。

1.2.6荚膜标本片制备将产气荚膜梭菌培养18小时的液体培养物0.5ml 注射入小白鼠腹腔，

10分钟后杀死小白鼠，置37℃温箱4～6小时，由于产气荚膜杆菌产生大量气体，可使小白鼠体内充满气体，腹部膨胀，剖检可见各脏器肿胀，并有许多气泡，尤以肝脏为甚。剖开肝脏进行涂片，干燥固定；用石炭酸复红液染色1分钟，

并用微火稍微加热，待标本放凉后水冲洗；加特殊媒染剂（升汞饱和液2份、20%鞣酸液2份、钾明矾饱和液1份混合而成）作用0.5分钟，水冲洗；最后用碱性美兰液染色1分钟，

水冲洗；吸水后油镜观察，结果为菌体被染成鲜明红色，荚膜呈蓝色，位于菌体外周。亦可将涂片直接用革兰氏染色法进行染色，结果菌体呈紫色，荚膜呈透明圈，位于菌体外周。用此法大批制片，染色后加盖片用中性胶封固，晾干后贴标签，放入标本盒内长期保存使用。2结果

从土壤中分离出的厌氧芽孢梭菌制备的菌种及芽胞和荚膜标本片均非常典型。菌种用于临床检验专业的厌氧芽胞梭菌培养实验和汹涌发酵实验，芽胞和荚膜标本片用于临床医学专业及其他医学类各专业的细菌特殊结构观察实验，取得了非常好的实验教学效果。3讨论

近几年来厌氧芽孢梭菌引起的感染及食物中毒病例明显增多，细菌的耐药性也在不断增高，这给临床医生治疗带来了很大困难，应引起高度重视。在实验教学中，临床标本来源有限，但从土壤中分离厌氧芽孢梭菌比较方便，操作简单，制备的标本片形态典型，可广泛应用于病原生物学实验教学。

参考文献：

[1]陈兴保.病原生物学和免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2007.[2]刘荣臻.微生物学检验[M].北京：

高等教育出版社，2007.蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉蒉

关键词：实验室；危险化学药品；安全教育中图分类号：G482

文献标识码：B

文章编号：1671-1246（2011）03-0097-02

实验室是高校实验教学、科学研究的重要场所，是培养学生动手能力、

创新能力，提高学生综合素质的重要基地。随着办学规模的扩大，学生实验和教师科研项目逐渐增多，危险化学药品的使用量随之增长。若学校的实验室安全防范措施不能及时跟上，防火防盗达不到相应要求，易发生火灾、爆炸及危险化学药品丢失等安全事故。因此，应加强师生危险化学药品安全意识教育，让他们正确使用、

储存和管理实验室危险化学药品，以保障学校实验教学、科研开发的正常进行，最大限度地减少安全事故[1]。

1危险化学药品储存过程中易产生的安全隐患1.1实验常见危险化学药品类型

（1）低沸点易燃易爆药品。如乙醚，沸点34.5℃，极易挥发，在空气中浓度达到1.85%~36.50%，

即可爆炸；长时间与氧接触和光照，可生成黏稠的过氧乙醚，受热可爆炸[2]。丙酮，沸点56.5℃，极易挥发，遇火即燃，燃烧时产生刺激性蒸气，有毒和麻醉性，使人头昏[2]。其他如甲醇、乙醇，沸点都较低，易挥发，遇火极易燃。这些试剂都是化学实验室中常用试剂。

（2）重金属盐类。如汞盐中的硝酸汞、硝酸亚汞、氯化汞、氯

浅议实验室危险化学药品管理

范珍

（安庆医药高等专科学校，安徽安庆246000）

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