蛋白质的定性定量分析PPT讲稿
《蛋白质的性质实验》PPT课件
Pr+ 醋酸铅或硫酸铜 沉淀
4、生物碱试剂：
Pr+ 鞣酸或苦味酸 沉淀
观察加水
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实验注意事项
(1).在操作过程中试管不能冲向他人以防止烫伤。 (2).操作强酸时要注意，吸管使用要规范。 (3).双缩脲反应铜离子不能多加，否则与氢氧化
钠形成蓝色的氢氧化铜，干扰试验结果。 (4).实验报告各部分内容都要包括，实验结果如
实验一 蛋白质的性质实验
王伟 中国海洋大学医药学院
2021/4/24
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实验目的
1. 加深理解所学有关的蛋白质性质的理论 知识
2. 掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量 分析的方法及原理
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实验原理
一、蛋白质呈色反应 二、蛋白质沉淀反应
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一、蛋白质呈色反应
❖ 蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及 其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生 成有色物质的反应。不同蛋白质分子所含的氨基酸 残基不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全 一样。
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（二）双缩脲反应
❖ 当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分 子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条件下 双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为 双缩脲反应。
❖ 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，此 类似反应也称蛋白质的双缩脲反应。凡分子中含有 两个以上肽键的化合物都呈此反应，故所有蛋白质 都能与双缩脲试剂发生反应。
OH + HNO3
HO
HO
NO2 + NaOH
O
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NO2 + H2O
蛋白质分析鉴定精品课件
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2. 分析多肽链的氨基酸组成。
将多肽链用酸或酶完全水解，再用离子交换树脂 （或用高效液相色谱）将各种氨基酸分离开，测 定其含量并计算各种氨基酸组成的百分比。下图 表示蛋白质的水解产物通过Moor-Stein Dowex 50 离子交换柱层析的自动分析结果。
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双向电泳：
2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究 中分离复杂蛋白质混合物的首选技 术。
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双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可 重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修 饰（如酶性或化学性降解等）。
a 加入脱水剂除去水膜 b 使pH=pI c 加入电解质使质点表面失去同种电荷。
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五、蛋白质的变性作用
天然蛋白质受到理化因素的影响， 氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭 到破坏，分子内部结构发生改变，致使 生物学 性质、理化性质改变的现象。
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物理因素： 加热、紫外线、X—射线、超声波
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双向电泳的分类
非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下 进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观 分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是 一样的
非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性 IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也 在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价 键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。
蛋白质的定量和定性分析方法
蛋白质的定量和定性分析方法蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，对于研究生物体的结构和功能具有重要意义。
为了准确地了解蛋白质的含量和性质，在科学研究和实际应用中，我们需要使用定量和定性分析的方法来研究蛋白质。
一、定量分析方法1. 低里德伯法（Lowry method）低里德伯法是一种经典而广泛应用的蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与碱式铜络合物在碱性条件下反应生成蓝色产物，通过比色法测定溶液的吸光度来计算蛋白质含量。
这是一种灵敏且相对简单的方法，适用于大多数蛋白质样品的定量分析。
2. 比色法（Colorimetric assay）比色法是一种常用的蛋白质定量方法，通过蛋白质与染料的结合来测定蛋白质浓度。
常用的染料有布拉德福蓝（Bradford）、库吉铃蓝（Coomassie Brilliant Blue）、BCA法（Bicinchoninic Acid assay）等。
这些染料与蛋白质结合后形成一种复色物，通过比色法测定溶液的吸光度可以定量分析蛋白质。
比色法具有操作简便、灵敏度高等特点，被广泛应用于蛋白质定量领域。
3. 分子标记法（Molecular tagging method）分子标记法是一种新兴的蛋白质定量方法，利用特定的分子标记物（如荧光染料、放射性示踪剂等）标记蛋白质，然后通过测定标记物的荧光强度或放射性信号来计算蛋白质浓度。
分子标记法具有高灵敏度、高特异性等优点，适用于微量蛋白质的定量测定。
二、定性分析方法1. SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定性分析方法，通过电泳将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离出来。
在电泳过程中，蛋白质在SDS（十二烷基硫酸钠）的作用下具有相同的电荷密度，只受到大小的限制而移动。
蛋白质在凝胶中的分离程度取决于其分子量大小，可以通过对比标准品的迁移距离来估计样品中蛋白质的相对分子量。
蛋白组学定量蛋白质组学.ppt
2
常用研究方法
以质谱技术为基础的化学标记定量方法 荧 光 差 示 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 （ F－2D－
质量变化依赖于氮原子数目，因此对未 知的蛋白质难以进行定量。
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（二）稳定同位素标记的必需氨基酸体 内标记(SILAC法)
高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸 (Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等，这些氨基酸细胞自身 无法合成，需要从外界摄入补充。
在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。
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MCAT策略流程：定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y 离子带Lys，因此被修饰。
在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现， 丰度比例一样，且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。
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MCAT策略流程：定量
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–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异
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羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例＝2 : 1
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缺点：
特异性不是很好，在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法
1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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第18章蛋白质-PPT课件
（2）依据蛋白质的化学组成分类 按照蛋白质的化学组成，可以分为
简单蛋白(simple protein)
和结合蛋白(conjugated protein) 。
简单蛋白
又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成 的肽链，不含其它成分。 1.清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于 动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易 溶于稀酸中。 2.谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白， 不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80 ％乙醇中。 3.精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 4.硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中， 分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。
3. 蛋白质的性质
蛋白质的性质取决于蛋白质的分子组成和结构特征，一 方面具有与某些氨基酸相似的性质，另外又具有一些高分 子化合物的性质。 (1) 两性解离和等电点 蛋白质是由氨基酸组成，在蛋白质 分子链中同样存在游离的碱性基团和酸性基团，如氨基、 羧基、胍基、咪唑基等，因此同样存在两性解离和等电点。 (2) 胶体性质 蛋白质的相对分子质量很大，其分子大小已 达到1～100 nm 的胶粒范围，其溶液属于胶体分散系。由 于蛋白质分子表面有许多极性基团，如—COO、—NH3+、 －OH、－SH、－CONH2等，天然蛋白质常以稳定的亲水 胶体溶液形式存在，蛋白质分子周围的双电层和水化层是 稳定蛋白质胶体系统的主要因素。
第18章 蛋白质
目的要求
1. 掌握蛋白质的元素组成和理化性质，了解
2. 蛋白质的分类。 2. 掌握蛋白质一级和二级结构的概念。
3. 熟悉蛋白质的三级和四级结构概念。
第二章蛋白质的定性定量分析【共54张PPT】
2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶
制备浓缩胶
装板
加样
电泳
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的 电荷差异
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
对各种纯化蛋白质反应不同
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定
SDS与蛋白质之间的结合程度
SDS-PAGE基本原理
封闭非特异结合位点 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；
Watch SDS-PAGE原理
Watch SDS-PAGE原理
80-100 ug/cm2
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白
+
pH 3
pH 7.5
Isoelectric Focusing
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
3–10
3–10NL 4–7 3–6
5–8
7–10
ReadyStripTM IPG Strips
蛋白质的定性定量检测
抗原的提取 与纯化
免疫动物或细 胞融合，制备 特异性抗体及
纯化
标记物复合 物的制备
观察和记 录结果
抗原抗体反应 和呈色反应
标本的 处理
（三）抗原-抗体反应
抗原-抗体反应：由抗原物质刺激机
体产生相应的特异性抗体后，抗原 和其特异性的抗体在体内或体外发 生结合反应的过程。
利用抗原、抗体在体外可以发生特异 性结合反应的特点，将其应用到细 胞组织化学中，可对各种抗原或生 物活性物质进行分离及检测。
第五章 蛋白质的定性定量检测
第一节 免疫组织化学的基本理论 第二节 蛋白质的定量检测 第三节 免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量 第四节 酶联免疫吸附试验（ELISA）
第一节 免疫组织化学的基本理论
一、形态学研究的方法（S） 二、组织化学 三、免疫组织化学
一、形态学研究的方法（S）
（一） 普通光镜术 （四）组织（细胞）化学术
（八）活体与活细胞染色（S）
（九）形态研究的定量术（S）
1. 形态计量术（体视学） 2. 显微分光光度术 3. 图像分析术 4. 流式细胞术
二、组织化学（histochemistry）
✓组织化学（histochemistry）：以组织学为 基础，应用物理和化学的技术方法显示细 胞组织结构中的各种化学成分，并对这些 物质进行定位、定性和定量，从而分析研 究生物体在生理或病理状态下细胞和组织 代谢、功能及形态变化规律的科学。
（四）免疫标记化学反应与检测
免疫标记化学反应：用荧光素等发光剂、 酶等呈色物或放射性核素等作为示踪物标 记抗体分子，在适宜的条件下（即适宜的 温度和pH等），标记抗体与抗原发生特 异性的反应。
常用标记物
1. 荧光素 （1）异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）：
蛋白质定量与定性分析报告
蛋白质定量与定性分析报告蛋白质定量分析与定性分析报告此次“蛋白质定量分析与定性分析”报告总共包括蛋白定量、蛋白简单定性、蛋白功能定性三个部分组成。
师兄的报告内容翔实，介绍生动，让我受益匪浅。
1. 蛋白质定量分析蛋白质定量分析是确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白的含量。
蛋白质的定量分析一般可从三个方面入手，一是基于蛋白质的元素组成特点，二是基于蛋白质的化学显色反应，三是基于蛋白质的光吸收特性。
蛋白质定量分析的方法有:280紫外吸光比色法、经典Bradford与Lowry检测法、BCA(二喹啉加酸)检测法、疏基测定检测法。
280紫外吸光比色法这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分及其含量，通常用于柱层分析过程中检测蛋白质的洗脱峰。
如下图，蛋白质中的Trp、Tyr、Cys残基含有共轭双键，在280nm有一紫外吸收高峰。
在一定浓度范围内，蛋白质的A280与其浓度成正比，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。
可以通过A280与A260的差值来计算出蛋白质浓度，如:蛋白质浓度(mg/l)=1.45×A280-0.74×A260。
蛋白质的第二吸收峰在240nm以下，214nm最大，此峰是由肽键引起。
可通过214nm与225nm的差值来计算出蛋白质的含量。
较为精确的公式为: ε(280) (M-1 cm-1)= (#Trp)(5,500) + (#Tyr)(1,490) + (#cystine)(125).1.2 经典Bradford与Lowery检测法1.2.1 Bradford检测法这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法。
该法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当于蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。
蓝色复合物在595nm波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白的含量。
高中生物竞赛课件：蛋白质的性质与分离、分析技术
（3）蛋白质的变性(denaturation)
次级键破坏(本质)，一级结构不变，组成成分和Mr不变 生物活性丢失（最主要的特征）
• 酶-催化能力、血红蛋白-氧运输、胰岛素-降血糖
理化性质改变
基团暴露
a) 疏水基团→溶解度↓→沉淀析出←肽链松散，相互缠
绕 b) 反应基团（-SH、-S-S-基、酚羟基等） 结晶能力丧失 球状蛋白质分子形状发生改变
③ 重金属盐：蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与重金属( 氯化高汞、硝酸盐、醋酸铅、三氯化铁)的正离子作用生 成不易溶解的盐 蛋白质变性，沉淀效率高，常用除去样品蛋白质杂质 化验血清非蛋白成分，用三氯醋酸或钨酸盐沉淀蛋白 质
蛋白质的性质与分离、分析技术
1、蛋白质的性质
（5）蛋白质的沉淀
④ 加某些酸类：苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质 形成不溶解的盐
蛋白质的性质与分离、分析技术
1、蛋白质的性质
（7）蛋白质含量的测定
双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与Cu2+可生成紫 红色的络合物，可用比色法定量。此法简便，受蛋白质氨基酸组 成影响小；但灵敏度不高、样品用量大，蛋白质浓度范围为0.510mg/mL
BCA比色法 ： 在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原为Cu+再与BCA 试剂(4，4'-二羧酸-2，2'-二喹啉钠)生成紫色复合物，于562nm有 最大吸收，强度与蛋白质浓度成正比。 优点 ： 单一试剂、终产物稳定，与Lowry法相比几乎没有干扰物 质的影响。尤其在TritonX-100、SDS等表面活性剂中也可测定。 其灵敏度范围一般在10-1200μg/mL
蛋白质的性质与分离、分析技术
1、蛋白质的性质
双缩脲法测定蛋白质含量ppt课件
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四、分光光度计的使用
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1．722型分光光度计的外形
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2.仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测 试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整 100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长
2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。
3.以0号管调零，测定各管完5整4版p0ptn课m件 光吸收值。
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四、结果处理
1.绘制标准曲线
以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制 标准曲线。
2.样品的计算
根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量 （mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。
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（3）比较吸光度的比值
纯DNA A260nm 1.8
A280 nm
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（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
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1．原理
Beer-Lambert（比尔）定律：
T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I
A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射
五、注意事项
1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间 应尽可能一致。
2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.比色杯的使用
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（二）双缩脲法测定蛋白质
H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2
H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法主要有两种：定性分析和定量分析。
1. 定性分析：常用的定性分析方法有蛋白质质谱技术，如蛋白质液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。
这些方法能够对样品中的蛋白质进行分离、鉴定和定性分析，可以确定蛋白质的氨基酸序列和特定的修饰情况。
2. 定量分析：常用的定量分析方法有标记蛋白质定量和非标记蛋白质定量。
标记蛋白质定量方法包括同位素标记法和化学标记法。
同位素标记法主要包括稳定同位素标记法（如氘代谱标法）和放射性同位素标记法（如放射性同位素测量法）。
化学标记法主要包括功能分子标记法（如荧光标记法和生物素标记法）和反应性标记法（如对硝基苯甲酸标记法和丙煮醛标记法）。
非标记蛋白质定量方法常用的有相对定量法和绝对定量法。
相对定量法主要通过蛋白质相关的性质，在样品中不同蛋白质的含量所具有的差别来进行定量。
常用的相对定量方法有比较蛋白质的荧光标记法、差减荧光凝胶法和差异凝胶电泳法等。
绝对定量法主要使用内标法，通过加入已知浓度的内标蛋白质来计算目标蛋白质的浓度。
常用的绝对定量方法有多重反应监测法（MRM）和定量蛋白质标准曲线法等。
蛋白质定性、定量分析
蛋白质定性、定量分析蛋白质定性定量分析（图片来源：百泰派克生物科技）蛋白质定性、定量分析随着质谱技术的飞速发展，利用质谱技术进行蛋白质（组）的定性和定量分析得到更为广泛的应用和研究。
1. 蛋白质定性分析：确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质。
蛋白质定性分析通常是指利用质谱法进行蛋白质鉴定和序列分析。
蛋白质定性分析分为top-down分析和bottom-up分析两种策略。
目前，bottom-up分析策略被更广泛的应用于蛋白质定性分析工作。
Bottom-Up（自底向上）和Top-Down（自顶向下）两种策略“自底向上”策略是指通过分析由蛋白质酶解生成的肽段来鉴定蛋白质。
当应用该策略来分析蛋白质组混合物时，因其类似于基因组测序的鸟枪法，所以又被称为鸟枪法蛋白质组学（Shot-gun Proteomics)。
“自顶向下”策略直接鉴定完整蛋白质，在翻译后修饰和蛋白质同素异构体鉴定方面有一些潜在的优势。
可是该策略的缺陷是蛋白质在气相中分离、电离及碎裂都十分困难。
而鸟枪法蛋白质组学由于将蛋白质酶解成肽段，使其在气相中更容易被分离、电离和碎裂。
2. 蛋白质定量分析：确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量。
蛋白质相对定量分析相对定量的目的是测定目的蛋白在两个或多个样本中的表达量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的表达量。
例如，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本做为对照组，经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的蛋白含量相对于对照组样品的百分比。
蛋白质绝对定量分析目前基于质谱的绝对定量蛋白质组学研究主要是指靶向蛋白质组学。
靶向蛋白质组学分析，是指对目标蛋白质（或修饰肽段）进行定性和/或定量分析，或者用于验证大规模蛋白质组学的结果。
基于质谱的靶向蛋白质组学分析方法，由于没有物种限制并具备多目标同时分析能力等优势，受到越来越多的关注和应用。
蛋白质含量测定ppt课件
（三）蛋白质的胶体性质
蛋白质是生物大分子，分子量可自1万至100万之 巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之 内。蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体，因为蛋 白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带 有相同电荷，相互排斥。蛋白质水溶的沉淀反应 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等 电点状态或失去水化层（消除相同电荷， 除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定 并将产生沉淀。
（二）蛋白质的两性电离 蛋白质是由氨基酸组成，其分子末端除有自由的 α-NH2和α-COOH外，许多氨基酸残基的侧链上 尚有可解离的基因，这些基团在溶液一定pH条件 下可以解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白 质溶液在某一pH时，蛋白质解离成正负离子的趋 势相等，即成兼性离子，净电荷为零，此时溶液 的pH称为蛋白质的等电点（isoelectric point,PI）。 蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带 负电荷，小于等电点时则带正电。 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 电泳种类：自由界面电泳、区带电泳（纸电泳、 凝胶电泳等）
4. 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有 些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功 能，称为复性(renaturation)。所示。但是许多蛋 白质变性后，空间构象严重被破坏，不能复原， 称为不可逆性变性。 5. 蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能 溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点， 则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状 物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物 可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸 和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用 (protein coagulation)。
H2NCH2COOH +3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (l) (1) 2NH3 +H2SO4 → (NH4)2SO4 (2) (NH4)SO4 +2NaOH → 2H2O+Na2SO4 +2NH3 (3) 此法灵敏度低,适用于0.2-1.0mg 氮,误差为2%, 费时8-10小时,将氮转化为氨,用酸吸收后滴 定.
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第一章 蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
基于蛋白质的 基于蛋白质的 基于蛋白质的 元素组成特点 化学显色反应 光吸收特性
➢ 蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％ 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
➢ 蛋白质的分子量范围 15～200 KD之间
➢ 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去
➢ 多亚基蛋白质分子量检测 ❖ SDS和巯基乙醇 ❖ 用其它方法测定分子量进行参照
➢ SDS-PAGE测定的准确性 ❖ 电荷异常或构象异常 ❖ 带有较大辅基的蛋白质 ❖ 某些结构蛋白
芳香族氨基酸的紫外吸收
优点 缺点
• 快速 • 对蛋白质无破坏性
• 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液
• 核酸可引起强干扰作用 •芳香族氨基酸含量差异可以起误差
计算方法
• 标准曲线法
• 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260
注意事项
• 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液 • 光密度范围
制备分离胶
制备浓缩胶
装板
加样
电泳
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结 合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种 蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质 分子间天然的电荷差异
二、考马斯亮蓝G-250检测法
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法
原理
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙 醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应 迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度 成正比，因此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量
优点 缺点
• 一种可靠的蛋白质定量方法 • 不同蛋白质之间差别很小 • 干扰物质多 • 某些试剂不稳定
• 使蛋白质发生不可逆变性
计算方法 注意事项
• 标准曲线法
• 在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱
• 许多干扰物质降低颜色反应 • 高盐浓度可引起沉淀
四、BCA (二喹啉甲酸检测敏感性高
缺点
•巯基试剂和去垢剂干扰 • 蛋白质发生不可逆的变性
第二节 蛋白质相对分子量测定
分子量测定 (molecular weight, MW)
质谱 (ESI-MS)
沉降平衡超速离心 排阻层析
动态弹性光散射 孔径梯度电泳
一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
1. 不连续系统原理 2. SDS-PAGE凝胶的制备
这是近年来新研制的一种改进的Lowry 测定法
原理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋ 还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物， 在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的 大小来计算蛋白质的含量
三、Lowry检测法
这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.
原理
首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试 剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在 745 ～750 nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可 根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量
1/16 %
一、紫外光谱 (A280)吸收法
这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰
原理
色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近
大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以 测定蛋白质溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中 蛋白质含量的快速简便的方法
蛋白质的定性定量分析课件
➢ 蛋白质定性分析 (qualitative analysis)
确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质
➢ 蛋白质定量分析 (quantitative analysis)
确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量
➢ 蛋白质含量的测定方法（重点掌握） ➢ 蛋白质相对分子量测定 (SDS-PAGE) ➢ 等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解） ➢ 蛋白质的免疫印迹分析 (western blot)
➢ 标准品的选择及处理 ➢ 待测样品的制备 ➢ 电泳分离及染色 ➢ 相对迁移率的计算
Watch SDS-PAGE操作
Analysis for SDS-PAGE electrophoresis
5. 注意事项
➢ 选择合适的胶浓度
➢ SDS与蛋白质之间的结合程度 ❖ 二硫键是否完全被还原 ❖ 溶液中SDS的浓度 ❖ 溶液的离子强度
SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具 有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子 量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈 对数线性关系
Watch SDS-PAGE原理
4. SDS-PAGE测定分子量的操作
所需时间 优点
缺点
• 10 min • 快速（反应时间仅需2 min） • 敏感，几乎没有蛋白质损失
• 对各种纯化蛋白质反应不同 • 用这种测定方法对蛋白质引起不
可逆的变性
计算方法 注意事项
• 标准曲线法
• 反应10～15 min后开始出现沉淀， 尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀
• 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确