疟原虫检验技术
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
● 半定量计数法 (厚血膜) 优点：方法简便 缺点：只能定性，不宜作为定量分析
● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜)
白细胞原虫密度计数法
➢ 镜检厚血膜，按视野顺序，记录200个白细胞中的 疟原虫数，如果原虫密度较低（200个白细胞中小 于100个疟原虫），可增加白细胞，计数500个。
➢ 密度单位:原虫数/μl ➢ 计算公式：疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者
疟原虫检验技术
黔东南州疾控中心检验科
寄生人体的四种疟原虫
间日疟原虫 [P. vivax，P.v] 恶性疟原虫 [P．Falciparum,P.f] 三日疟原虫[P．Malariae,P.m] 卵形疟原虫[P．Ovale,P.o]
我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另 二种少见，近年偶见国外输入病例。 其它疟原虫 诺氏疟原虫(Plasmodium nowlesi)
每微升血白细胞数 = 疟原虫数/μl血。 ➢ 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个
原虫镜检---金标准
●当前分子生物学、血清学技术快速发展, 但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替 代的确诊疟疾的 “金标准”
●显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴 别4种人体疟原虫
疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点
疟原虫密度计算
计算疟原虫密度的三种方法：
● 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) 优点：可作为定性和定量分析
➢ 血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇 等舔食血膜；
➢ 制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要 加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果．
血片染色
两种染色方法:
●吉氏染色法
1. 染色原液配制 2. 门诊快染、慢染 3. 成批染色和溶血染色
● 瑞氏染色法
WHO推荐使用吉氏染色法
●整个染色液配制时间不能少于5个小时
血片的染色
染色用水和冲洗用水配制
常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水 用pH7.0～pH7.2的缓冲液。
血片染色
薄血膜的固定
厚血膜充分干燥, 用甲醇固定薄血膜， 平放待干 （要点：甲醇不能 触碰到厚血膜）
血片染色
操作1 （快染） 量筒内 量2ml缓冲液(PBSPH7.0) 或净水，直接滴加吉氏原 液7滴，混匀，滴入待染标 本的厚薄血膜上，染色 10min，清水缓缓冲洗，晾 干（血膜朝内面）镜检。
内容提纲
➢ 血片制作与染色 ➢ 疟原虫计数 ➢ 疟原虫的基本形态特征
血片制作
➢ 第一步：载玻片的清洗 用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，清水
冲洗后凉干，浸于95% 的乙醇中1小时以上
用绸布擦干置干燥环境中保存。
第二步：患都信息的核实
采集血样涂片时，首先要核对患者的 姓名和年龄并在玻片的右侧编号
第三步：采集血样
采血部位：耳垂或无名指，
取血方法：通常在耳垂取血， 先用75%酒精棉球消毒取血部位 ，待酒精干后，用左手拇指和 食指紧捏耳垂上方或无名指指 尖，右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。厚血 膜血量约一粒米大小,薄血膜血 量为厚血膜的一半或1/3。
第四步：血片制作
外观吉氏染色血片
偏酸 标准
偏碱
染色质量影响因素
➢配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助 于提高镜检质量； ➢染液稀释后使用时间：原液必须临用时稀释，随 配随用； ➢染液的稀释浓度； ➢染色时间。
染色质量影响因素
➢染色稀释用水: PH7.0-7.2清洁水。
用水过酸，可致感 染的RBC上的点彩 染不出来；
厚血膜溶血染色
放置多时未染色的血片（3天以上，薄片已用甲 醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进 行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液 染色30分钟。然后用清水漂洗干净,晾干。
质量好的染色
显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性
用水过碱，则使薄 血膜上的RBC染成 灰蓝色，致使R的 胞浆难以辨论。
染色质量影响因素
➢固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜； ➢血膜在制备后应尽量能在当天染色，一般夏 天不超过48小时，冬天也不能超过72小时,放置 时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。
疟原虫镜检
● 疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 ● 疟原虫密度计数方法 ● 人体四种疟原虫的形态特征
操作2 (慢染) 量筒 内量2ml缓冲液或净水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀 ，滴入待染标本上，染色 30min。清水缓缓冲洗，晾 干镜检。
成批血片染色
将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染 液（3毫升吉氏染色液加缓冲液或净水97毫升，混匀） 浸没血片，染色30分钟。 （如染液稀释液不合标准时，得酌情增减染色时间 和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染 色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检。
厚血膜 用推片的一角，从取 血部位刮取约4微升血量 （相当于火柴头大小）， 使血滴与平置的载玻片接 触，再由里向外一个方向 旋转，转2~4圈，涂成直 径0.8~1厘米大小圆形厚 血膜
薄血膜再取一小滴血.将血置 于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将 推片的边 缘紧贴载玻片，轻轻上下 移动，使血液沿边缘散开， 然后匀速地向前推进，形 成薄而平铺的薄血膜
薄血膜 厚血膜
制片过程图示
标签
标准的疟疾厚薄血膜片
●厚血膜血量不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列
标签
血片的制作
×
×
×
wk.baidu.com
×
×
√
血片制作影响因素
➢ 载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀 分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；
➢ 厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-10个白细胞为宜；
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B type) 甘油 (纯) 甲醇 (纯)
5g 250ml 250ml
●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨， 直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加 入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗 ，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀， 置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。 保存时间越长染色效果越好。
● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜)
白细胞原虫密度计数法
➢ 镜检厚血膜，按视野顺序，记录200个白细胞中的 疟原虫数，如果原虫密度较低（200个白细胞中小 于100个疟原虫），可增加白细胞，计数500个。
➢ 密度单位:原虫数/μl ➢ 计算公式：疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者
疟原虫检验技术
黔东南州疾控中心检验科
寄生人体的四种疟原虫
间日疟原虫 [P. vivax，P.v] 恶性疟原虫 [P．Falciparum,P.f] 三日疟原虫[P．Malariae,P.m] 卵形疟原虫[P．Ovale,P.o]
我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另 二种少见，近年偶见国外输入病例。 其它疟原虫 诺氏疟原虫(Plasmodium nowlesi)
每微升血白细胞数 = 疟原虫数/μl血。 ➢ 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个
原虫镜检---金标准
●当前分子生物学、血清学技术快速发展, 但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替 代的确诊疟疾的 “金标准”
●显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴 别4种人体疟原虫
疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点
疟原虫密度计算
计算疟原虫密度的三种方法：
● 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) 优点：可作为定性和定量分析
➢ 血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇 等舔食血膜；
➢ 制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要 加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果．
血片染色
两种染色方法:
●吉氏染色法
1. 染色原液配制 2. 门诊快染、慢染 3. 成批染色和溶血染色
● 瑞氏染色法
WHO推荐使用吉氏染色法
●整个染色液配制时间不能少于5个小时
血片的染色
染色用水和冲洗用水配制
常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水 用pH7.0～pH7.2的缓冲液。
血片染色
薄血膜的固定
厚血膜充分干燥, 用甲醇固定薄血膜， 平放待干 （要点：甲醇不能 触碰到厚血膜）
血片染色
操作1 （快染） 量筒内 量2ml缓冲液(PBSPH7.0) 或净水，直接滴加吉氏原 液7滴，混匀，滴入待染标 本的厚薄血膜上，染色 10min，清水缓缓冲洗，晾 干（血膜朝内面）镜检。
内容提纲
➢ 血片制作与染色 ➢ 疟原虫计数 ➢ 疟原虫的基本形态特征
血片制作
➢ 第一步：载玻片的清洗 用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，清水
冲洗后凉干，浸于95% 的乙醇中1小时以上
用绸布擦干置干燥环境中保存。
第二步：患都信息的核实
采集血样涂片时，首先要核对患者的 姓名和年龄并在玻片的右侧编号
第三步：采集血样
采血部位：耳垂或无名指，
取血方法：通常在耳垂取血， 先用75%酒精棉球消毒取血部位 ，待酒精干后，用左手拇指和 食指紧捏耳垂上方或无名指指 尖，右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。厚血 膜血量约一粒米大小,薄血膜血 量为厚血膜的一半或1/3。
第四步：血片制作
外观吉氏染色血片
偏酸 标准
偏碱
染色质量影响因素
➢配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助 于提高镜检质量； ➢染液稀释后使用时间：原液必须临用时稀释，随 配随用； ➢染液的稀释浓度； ➢染色时间。
染色质量影响因素
➢染色稀释用水: PH7.0-7.2清洁水。
用水过酸，可致感 染的RBC上的点彩 染不出来；
厚血膜溶血染色
放置多时未染色的血片（3天以上，薄片已用甲 醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进 行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液 染色30分钟。然后用清水漂洗干净,晾干。
质量好的染色
显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性
用水过碱，则使薄 血膜上的RBC染成 灰蓝色，致使R的 胞浆难以辨论。
染色质量影响因素
➢固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜； ➢血膜在制备后应尽量能在当天染色，一般夏 天不超过48小时，冬天也不能超过72小时,放置 时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。
疟原虫镜检
● 疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 ● 疟原虫密度计数方法 ● 人体四种疟原虫的形态特征
操作2 (慢染) 量筒 内量2ml缓冲液或净水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀 ，滴入待染标本上，染色 30min。清水缓缓冲洗，晾 干镜检。
成批血片染色
将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染 液（3毫升吉氏染色液加缓冲液或净水97毫升，混匀） 浸没血片，染色30分钟。 （如染液稀释液不合标准时，得酌情增减染色时间 和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染 色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检。
厚血膜 用推片的一角，从取 血部位刮取约4微升血量 （相当于火柴头大小）， 使血滴与平置的载玻片接 触，再由里向外一个方向 旋转，转2~4圈，涂成直 径0.8~1厘米大小圆形厚 血膜
薄血膜再取一小滴血.将血置 于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将 推片的边 缘紧贴载玻片，轻轻上下 移动，使血液沿边缘散开， 然后匀速地向前推进，形 成薄而平铺的薄血膜
薄血膜 厚血膜
制片过程图示
标签
标准的疟疾厚薄血膜片
●厚血膜血量不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列
标签
血片的制作
×
×
×
wk.baidu.com
×
×
√
血片制作影响因素
➢ 载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀 分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；
➢ 厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-10个白细胞为宜；
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B type) 甘油 (纯) 甲醇 (纯)
5g 250ml 250ml
●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨， 直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加 入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗 ，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀， 置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。 保存时间越长染色效果越好。