原位杂交实验步骤

原位杂交实验步骤

原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。

根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。

一、基本要求

1.组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。

2.固定目的是：

（1）保持细胞结构；

（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；

（3）使探针易于进入细胞或组织。

最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。

3.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：

（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。

（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。

（3）蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），还有链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。

4.杂交缓冲液孵育：

杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。

5.防止污染：

由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。

6.双链DNA探针和靶DNA的变性：

杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交（包括检测RNA时），双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。

杂交液：

杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。

杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的杂交温度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。

所以，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的（尤其对双链核酸探针）。

在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。

探针的浓度：

探针浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5~5.0μg/ml（0.5~5.0ng/μl）。最适宜的探针浓度要通过实验才能确定。

探针的长度：

一般应在50-300个碱基之间，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。

二、试剂准备

1.0.1M PBS(pH7.2)：Na2HPO4•12H2O61.6g、NaH2PO4•2H2O5.6g、NaCl9g，加ddH2O 至2000ml，高压灭菌。

2.0.2M PB((pH7.2)：Na2HPO4•12H2O61.6g、NaH2PO4•2H2O5.6g加ddH2O至1000ml，高压灭菌。

3.0.1M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1M PBS，定容至100ml，高压灭菌。

4.4%多聚甲醛：多聚甲醛40g加ddH2O400ml，加热至70℃左右，用1M NaOH调pH 至7.0，用ddH2O定容至500ml，再加0.2M PBS500ml，总体积为1000ml。

5.16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4g、小牛血清白蛋白（BSA）0.4g、聚蔗糖0.4g，加dd H2O至10ml，无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。

6.预杂交液：去离子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2ml、1M Tris-HCl(pH8.0)0.2ml、5M NaCl1.2ml、0.5M EDTA(pH8.0) 0.04ml、0.1M二硫苏糖醇2ml、ddH2O2.21ml，总体积为10ml。无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。临用前加入50mg/ml变性鲑鱼精DNA75μl/ml。

7.20×SSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加水至800ml，用2N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。

8.抗体稀释液：Triton X-10080μl、BSA0.2g，以0.05M PBS定容至20ml。

9.TSM1：1M Tris-HCl(pH8.0)10ml、5M NaCl2ml、1M MgCl21ml，加ddH2O100ml。TSM2（新鲜配制）：1M Tris-HCl(pH9.5)10ml、5M NaCl2ml、1M MgCl21ml，加ddH2O 至100ml。

显色液（临用前现配）：5ml TSM2加显色液原液（NBT/BCIP）150μl，并加适量左旋咪唑