几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价

几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价

作者：傅翔

来源：《医学信息》2016年第01期

摘要：目的评价几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果。方法根据大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌的特异基因作为目的基因，设计相应的引物，并进行实验优化以确立对4种肠道致病菌的检测体系。并对市售经果汁样品人工随机染菌后进行模拟样品验证。结果该多重PCR方法能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片段，且特异性较强。同时能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。结论利用建立的多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌。

关键词：肠道致病菌；多重PCR检测；效果评价

随着人们健康意识的提升，对于食品安全问题关注度逐渐提升。对于食品安全事件来说，其中最大的元凶在于食源性致病菌的存在。这些食源性致病菌的组成是多样性的，其中，金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌（伤寒沙门菌、肠炎沙门菌）、产气荚膜梭菌及变形杆菌等引起的食源性疾病居于世界前列。在这种情况下，引起了医学界广泛的重视[1]。在传统的致病菌检测过程中，常用的方法为生理生化、血清型水平等等，但是，以上种种方法具有测试时间较长，费时、费力等特点，在灵敏度测试方面具有一定的局限性。故应建立一种较为快速、简便并具有一定灵敏度的检测方式，其中，以多重PCR检测最具效力，并成为研究的热门。本次研究拟建一种多重PCR检测方式，可以有效的检测出单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌

O157、副溶血性弧菌及普通变形杆菌4种肠道致病菌，以期达到临床检测效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料菌种以及来源：副溶血性弧菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌等均购于北京兰博瑞公司。单核细胞增生李斯特菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、志贺氏、空肠弯曲菌及大肠杆菌O157等均保存于重庆市疾病预防控制中心。

主要试剂及仪器：DNA的提取试剂盒、PCR试剂都是由北京全式金生物有限公司提供。营养琼脂培养基以及胰酪胨大豆琼脂培养基、血平板以及溶菌肉汤液体培养基、革兰阴性增菌液等都是由北京陆桥技术有限责任公司成品配置而成。其中，为了有效培育菌群，还准备了恒温培养箱以及水浴箱，均为德国进口产品，同时，所用的离心机3K30型号、梯度PCR仪器

ProS型号均为德国进口产品，而PowerPacUniversal164-5070电泳仪以及EC紫外成像系统均为美国进口产品。

1.2方法

1.2.1菌株培养及DNA提取在菌株培养过程中，将大肠杆菌以及变形杆菌用营养琼脂培养基予以培养，并保证其保持在37℃，然后在其中挑选出可用的3～5个菌种，将其接种到LB 液体培养基当中。其他菌株的培养方式亦是如此。在这些菌种的DNA提取过程中，应安全使用说明予以执行，确保正规提取。

1.2.2引物的设计与合成将4种细菌的基因序列予以提取，并通过比对，筛选出不同的特异基因作为靶序列，同时依据靶序列形式设计出相应的引物。其合成则是由北京锐捷生物有限公司完成。

1.2.3单重PCR扩增及多重PCR体系建立对上述的4种细菌实施单独扩增，并呈现出反应体系。其扩增条件在于90℃预变性2.5min；90℃变性30s，65℃退火30s，75℃延伸30s，36个循环；75℃延伸10min。多重PCR体系的建立是在单重的基础上完成的，多了2个循环模式，并依据电泳条带的亮度来确定其最佳的退火温度。

1.2.4多重PCR反应特异性、灵敏性检测及模拟果汁中细菌检测。多重PCR反应特异性检测方法为：将所有的菌群加入在同一个反应体系当中，并加入本次研究中的4种细菌对应的特异性引物，进而实施多重PCR扩增；多重PCR反应灵敏性检测是将4种细菌予以培养以后的24h，将其悬液取出，并进行梯度稀释，完成稀释以后按1：3：2的比例提取DNA，按优化后的多重体系予以反应；模拟果汁中细菌检测，购买不同的果汁，将其作为样品添加，并取一定量的稀释过的菌悬液予以混合，并过夜培养，取1ml的沉淀物，依据1：3：2的比例提取核酸，实施多重PCR检测。

2 结果

多重PCR方法效果显著，能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片段，进而展现出独特的结果形式。其中，单核细胞增生李斯特菌扩增片段为165bp，大肠杆菌O157扩增片段为357bp，变形杆菌扩增片段为518bp，副溶血弧菌扩增片段为187bp，且特异性较强。对4种目标菌的检测灵敏度可达到102CFU·mL-1。能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。

3 讨论

多重PCR检测能够有效的检测出常见肠道的致病菌，对于食品安全来说具有一定的保障[2]。这种检测方式主要的表现在于在同一反应体系中加入不同种类的目的基因引物，以达到一次反应下实现多种目的基因的有效扩增[3]。在临床实践过程中，因为一个体系当中各个基因组、引物之间具有一定的排他性，在实施处理过程中，常常会出现一定的影响现象，因此，应予以实施一定的优化，以完善检测效果。

本次研究结果显示，对于PCR体系的优化应包括浓度以及退火的温度两个方面。在本次研究中，通过正交设计的方式，能够有效的将各组间的浓度、退火温度等予以掌握。除此之外，对于PCR反应的特异性而言，其主要表现在于引物与模板的匹配度，有效的匹配形式是确保其展现特异性的必要形式。与此同时，在本次研究中，一次性加入了许多不同的菌群引物，并在试验过程中，分别扩增出相应菌的基因片段，进而实现了一次性检测的目的，体现了一定的时效性。在灵敏度检测以及模拟果汁检测方面，与前人的研究著作中的数据大致相同，证实了检测结果的一致性[4-5]。

综上所述，利用建立的多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌。与传统的检测形式相比，具有高效、快速、准确以及特异性强的优势，能够有效节省人力、物力以及财力，提高检测水平的同时，进而提高病原菌的检疫检验效率。

参考文献：

[1]何伟，刘燕，钟文辉，等.土壤环境中肠道致病菌的多重PCR检测研究初探[J].环境科学学报，2013，02（05）：1341-1346.

[2]王增国，相莲，吴守芝，等.一种多重PCR方法快速鉴定7种常见肠道病原菌[J].疾病监测，2013，05（05）：412-415.

[3]翁思聪，朱军莉，励建荣.水产品中4种常见致病菌多重PCR检测方法的建立及评价[J].水产学报，2011，01（02）：305-314.

[4]尤元海，曾浔，张建中，等.重要肠道病原菌多重PCR-基因芯片检测方法研究[J].中国生物工程杂志，2009，09（12）：79-84.

[5]陈迪，杨银元，李凌飞.三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测[J]，西南农业学报，2011，05（06）：2359-2362.

编辑/金昊天