疟原虫的镜检技术-制片染色

注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染 液的pH值7.0-7.2较好。 染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合， 使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞 和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱时， 红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色， 不易观察。
姬氏染液的染色方法
血片干燥后,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜（瑞氏不需固定）, 再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白(新制作的也可直接染色)，然后 再进行染色。 成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入 3%姬氏染液稀释液（3毫升姬氏原液加缓冲液或蒸馏水97毫升， 混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30-40min（根据当地实际 情况，酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液漂洗干净， 将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液2-3滴，加缓冲液 或蒸馏水1ml，混合均匀，染色15-20分钟左右，然后用清水轻轻 将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。（勿直接倾倒掉玻片上的染 液，防止渣滓附着在玻片上冲不掉影响镜检） 较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈 蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。
染液的种类
疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏 （Wright stain）和姬氏染液（Giemsa stain）。 这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美 蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。 我们主要用姬氏染液，它具有方便，染色效果稳 定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间 短，但染色效果不如姬氏稳定，主要在门诊量大 的门诊实验室使用。
染液的染色原理
是染料与被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一 种化学反应。 红、白细胞和疟原虫所含蛋白质的氨基酸电离出 的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带 的阴阳离子相互结合便被染上不同的颜色。 疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色，红细胞、疟 原虫和白细胞核被染成紫红色。
红、白细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带 正电荷的-NH3+和一个带负电荷的-COO-。多色染剂的碱性染料美蓝的有色基 团带阳离子，可与细胞中带负电荷的-COO-部分结合，使之成为蓝色。疟原 虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质，故被 染成蓝色。酸性染料伊红的有色基团带阴离子，可与细胞中带正电荷的 NH2+部分结合，使之呈红色；但美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着 色，可美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，于是，在媒染物与染料的共同 作用下，疟原虫和白细胞核被染成紫红色。
位置，位于玻片左半部分或第4格前缘到第6格中部 ； 外观，舌状厚薄均匀，无划痕；应在玻片上形成平 铺的红细胞，红细胞之间互相接触而不相互重叠。
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜位置
血膜的编号
血膜制成后，立即在玻片面上贴 标签或写上受检者的号码，以防 差错；待薄血膜干后再用铅笔于 薄血膜中写上血片种类的代号和 受检者的个人编号，依次顺序插 入标本盒内。
10 10 10 10 10
5 5 5 5 5
直径（10分） 外观（10分） 血量（10分）
圆形稍不均不整齐 略多或略少 稍偏右或偏左 稍大或稍小 舌状稍不均
厚薄不匀影响着色 过多或过少 偏右或偏左过多 过多或过少 厚薄不匀呈波浪型
薄血膜（40 分）
10
10 10 4
7
8 8 3
5
5 5 2
位置（10分） 长度（10分) 外观（10分) 外观（4分）
制作血膜注意事项
（1）刚涂制的血膜要平放在标本盒内 厚血膜未干
前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不 均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应 注意防尘，防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时 装入标本盒并盖严。 （2）血膜应自然干燥 切忌在毒太阳下晒或火烤，加 快其干燥可采用手背上或衣服摩擦、风吹，干透后才能用 甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24-48h内固定染色；冬 天也不能超过 72h 。放置时间越久，厚血膜越不易溶血， 染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定 （1～3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干后装入 盒内盖严，待以后染色。
（5）冲洗方法 应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层
溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒附着于血膜。
血片染色注意事项
固定薄血膜时勿将甲醇触碰到厚血膜。 冲洗染液时，，质量较好。 玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜。 记号笔：玻片上书写号码。 吸管，吸头，等。
血膜的制作（取血时间）
现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊 断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取 血时机，例如： （ 1 ）间日疟：一般要观察裂殖体和环状体，那么 就要在发冷（寒战）期取血，此时疟原虫的成熟裂 殖体涨破红细胞。 （ 2 ）恶性疟：一般要观察环状体，较理想的取血 时间是在发作后 2-20h 内取血，此时环状体发育至 最高峰。要观察配子体，得在末梢血出现环状体之 后的7-10天。
（3）染液稀释后使用时间 必须现用现稀释染液，当时使
用，一般在0.5h内染色力最强。 姬氏和瑞氏染液的主要成 份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在甲醇中 溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。
影响染色效果的因素
（4）染色时间 染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释
浓度和气温而适当增减。染色时间长染色效果好，反之较差。 室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。
采血部位
F （1）成人：耳垂或无名指；
（2）婴幼儿：拇趾或足跟； 通常在耳垂取血，先用75% 酒精棉球消毒取血位，待 酒精干后再取血。
用于检查疟原虫的血涂片有两种：
一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种 是血液涂成圆盘状，称厚血膜。最好一张玻 片上同时制作厚、薄两种血膜。
涂制厚、薄血膜的位置
血片制作染色评估考核标准
质量标准 项目 检查内容
分值 分
值 略多或略少 稍偏右 0.7～0.8 或1.0～1.2cm 7 7 8 8 7 过多或过少 偏右过多 <0.7或>1.2cm
分
血量（10分） 位置（10分）
厚血膜（40 分） 血片制作 （80分）
4～5ц l 玻片右1/3 0.8～1.0cm 圆形厚膜均匀，边缘整齐 1～1.5ц l 玻片1/2～1/3处 2.5～2.0cm 舌状厚薄均匀 蓝紫色
作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各 1 个。方 法是将载片分为 6 等分，第 1 、 2 格备贴标签及编号 用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘 至第6格中部。
标签
标本片
发热病人血片
厚血膜的制作
取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片， 用推片的一角，从取血部位刮取①约4～5微升血量 （相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触， 再由里向外一个方向旋转，转2～4圈，涂成②直径 0.8～1cm大小圆形厚血膜。 位置，位于玻片右1/3处（中央偏右或6等份中的与贴 标签的1、2份相邻的第3份中部）。外观，圆形厚薄 均匀，边缘整齐。过厚易于脱落，过薄达不到检出率 的要求，以1个油镜视野5-10个白细胞为宜。
深蓝色 染色过深，原虫胞浆与核 均呈深蓝色
深红色或灰白色 染色过浅，胞浆蓝色不易显 见，核淡红
血片染色质量（10分）
镜下（6分） 外观（5分） 镜下（5分）
白细胞、疟原虫胞浆蓝色， 6 核红色 光洁无油灰 无沉渣
5 5
4
3
稍有油污 稍有沉渣
4 4
油灰粘连 沉渣多或有杂菌
2 3
血片清洁度（10分）
影响染色效果的因素
姬氏染液浓度
门诊染色
快染 配制8-10%染液(每张血片约需染液2ml):量 筒内量2ml缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加姬氏 原液4-5滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上， 染色10-15min，清水细缓冲洗，晾干镜检。 慢染 配制3%染液:在染色量筒内量2ml蒸馏水或 新鲜凉开水，再滴加姬氏原液2滴，混匀，滴入 待染标本上，染色30~40min。清水细缓冲洗，晾 干镜检。
薄血膜的制作
用推片一端边缘的中点从取血部位①刮取约1～1.5 微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平 置的载玻片中线接触，并形成25～350夹角，待血液 向两侧扩展约② 2cm～2.5cm宽时，均匀而迅速地 从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。注意：推 制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹 角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。 也可载玻片平置在桌面上操作。
疟原虫镜检技术 ——制片与染色
市疾病预防控制中心
主讲内容
厚薄血膜的制作。 厚薄血膜的染色。
血膜的制作--所需耗材
载玻片：新玻片：浸入洗涤剂溶液中10-20分钟，棉巾
擦拭，再用清水冲洗，晾干，最后用棉巾将玻片擦亮使用 （实验中，用纸巾充分擦拭后即可使用）；已用过的玻片： 浸入洗涤剂溶液中1-2天（或5%煮沸肥皂水中1-2小时）， 再放入洗涤剂溶液中1-2小时，擦去血膜，清水漂洗干净， 擦亮使用（实验中，尽量使用新玻片）。
血片染色好坏除与玻片清洁度、血片制作质量和染 色技术等有关外，还受到以下因素的影响： （1）染剂、溶剂的质量 染料、甲醇和甘油必须用分析纯，
且在配制时所用的器具必须干净且无水份。
（2）染液的新旧 染液存放时间越久，染色力越强。新配制
的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。 通常在染液配制1～2周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖 密，以防吸潮而影响染液质量。