原位杂交原理

2） 第一向凝胶储备液（含28.38%丙烯酰胺、1.62%甲叉双丙烯 酰胺）：取7.09g丙烯酰胺溶于双蒸水后加入0.405g甲叉双丙烯 酰胺。待溶解完全后定容至25ml，置于棕色瓶内于， 4℃冰箱 保存。 3） 第一向电极母液（临用前稀释10倍）： 正电极母液（0.1mol磷酸）：取6.75ml磷酸，用去离子水定 容至1000ml。 负电极母掖（0.2mol NaOH）：取16g NaOH，用去离子水定 容至2000ml。 4）样品覆盖掖（含8.0mol/L尿素、0.4% Ampholine pH5-7、 0.4% Ampholine pH6-8、0.4% Ampholine pH3.5-10、5mmol/L K2CO3）：取新鲜尿素4.8g，0.1ml Ampholine pH5-7，0.1ml Ampholine pH6-8，0.1ml Ampholine pH3.5-10，1ml 50mmol/L K2CO3，用双蒸水定容到10ml。用Eppendorf管分装，每管100ul， 置于－20℃冰箱保存。
2. 第二向的加样操作与相应的单向电泳不同。经过第一向 IEF-PAGE，蛋白质在第一向的凝胶柱内得到了初步的分离。 在进行第二向SDS-PAG时，其加样方式是将第一向电泳后的凝 胶柱包埋在第二向的凝胶板内，通常包埋于凝胶板的上端。由 于第二向的电泳分离系统不同于第一向，因此必须将第一向电 泳后的凝胶柱在包埋于第二向凝胶板之前，预先在第二向的电 泳分离系统内进行震荡平衡。所用的平衡液通常与单向SDSPAG所用的蛋白质样品处理液相一致，内含-巯基乙醇和SDS 等。经过震荡平衡，凝胶柱内原有的第一向分离系统被第二向 的电泳分离系统所取代。其中-巯基乙醇使蛋白质组分分子的 二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质充分结合，从而完 成第二向SDS-PAGE的样品处理，即可进行第二向电泳。
现代生物学实验技术
实验一IEF/SDS—聚丙烯酰胺 凝胶双向电泳
一. 实验原理 聚丙烯酰胺双向电泳是一种由任意两个单向聚丙烯酰胺电泳组 合而成的，在第一向电泳后再与第一向垂直的方向上进行第二 向电泳的分离方法。其基本原理是第一项基于蛋白质的等电点 不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectricfocusing )；第二项 则根据分子量的不同大小进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分离,把复杂蛋白质混 合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过电荷和质量两次分离 后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
5）平衡液（含10%甘油、5%-巯基乙醇、2.3g SDS 、0.625mol /LTris-HCI、55ml甲醇）：取10ml甘油、5ml -巯基乙醇、 0.5ml浓盐酸、2.3g SDS、0.757gTris，先用20ml双蒸水溶解， 然后加入55ml甲醇，最后用双蒸水定容到100ml。置棕色瓶中于 4℃冰箱保存。 6）第二向凝胶储备液（丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1）：取 29g丙烯酰胺溶于双蒸水后加入1g甲叉双丙烯酰胺，待溶解完全 后定容至100ml，置于棕色瓶内于4℃冰箱保存。 7）分离胶缓冲液（1.5mol Tris-HCI，pH8.8）：取90.86gTris， 溶于400ml双蒸水中，用浓盐酸调pH到8.8，最后定容至500ml。 8）浓缩胶缓冲液（1.0mol Tris-HCI，pH6.8）：取60.56gTris， 溶于400ml双蒸水中，用浓盐酸调pH到6.8，最后定容至500ml。 9）SDS-PAGE电极贮存液（临用前稀释5倍）：900ml去离子水 中溶解15.1g Tris和94g甘氨酸，然后加入50ml 10%(w/v)的电 泳级SDS贮存液，用去离子水定容至1000ml。
二. 实验步骤
蛋白质提取：称取1-1g水稻幼苗或200粒水稻胚，用5ml 0.1mol/L的 TrisHCl提取液(内含2 mmol/L二硫苏糖醇、2 mmol/L抗坏血酸、2 mmol/L 半胱氨 酸、 5 mmol/L EDTA、2% -巯基乙醇， pH8.8 )充分研磨，12000g离心10 min，测定上清液的蛋白质含量 ，加入10倍体积的预冷丙酮 ，置-20℃ 下沉 淀2-3h，4℃，12000 g离心20 min，沉淀用适量的样品裂解液溶解，蛋白质 含量控制在15-20g/l ，-20℃下保存备用。 １．试剂配制： 第一向试剂： 1 ）样品裂解液（内含 9.5mol/L 尿素、 2% 非离子型去污剂 NP-40 、 0.8% Ampholine pH5-7、0.8%Ampholine pH6-8、0.4%Ampholine pH3.5-10、2%二 硫苏糖醇、5 mmol/L K2CO3）：取5.7g新鲜尿素，2ml 10%非离子型去污剂NP40，0.2ml Ampholine pH5-7，0.2ml Ampholine pH6-8，0.1ml Ampholine pH3.5-10，0.2g二硫苏糖醇（DTT），1ml 50mmol/L K2CO3，用双蒸水定容到 10ml。用eppendorf 管分装，每管100l，置于－20℃冰箱保存。
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IEF/SDS-PAGE双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在 1975年根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。 采用IEF/SDS-PAGE分离蛋蛋白质，第一向IEF/SDS-PAGE所 用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向SDS-PAGE所用的为 板状。IEF/SDS-PAGE与IEF-PAGE和SDS-PAGE的区别在于： 1. 第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第 一向IEF-PAGE时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与 SDS结合以利于第二向SDS-PAGE的进一步分离，必须在第一 向电泳系统内加入高浓度的尿素和适量的的非离子去污剂NP40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两种试剂外还含 有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋 白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内的 二硫键，促使蛋白质变性和肽链舒展，从而有利于蛋白质分子 在较为温和的条件下与SDS充分结合。