小鼠单抗腹水纯化步骤

小鼠单抗腹水纯化

一、XX ---- 辛酸一硫酸铵法

【原理】

在酸性条件下（pH=

4.5）,非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分lg）,能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸一硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】

1、60mM 的醋酸缓冲液（pH

4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，力口ddH

20 至200ml，调pH 为

4.04.

10.2mM 乙酸

49.2ml，折合566卩的冰乙酸。

0.2M醋酸缓冲液母液60ml: O

20.2M 乙酸钠

10.8ml（

0.2M 乙酸钠：

2.72g三水合乙酸钠（MW

136.08）O 溶解于100mlddH

20XX）

2、10*PBS(

0.1M,pH

7.4)500ml 取0.2M PB母液250ml 加水定容到500ml,加入45gNaCI (使NaCI终浓度为9%),此时pH约为

7.35，调pH 至

7.4.

0.2M PB母液250ml：

0.2M Na

2HPO

4202.5ml (折合

14.5gNa

2HPO

4 12H

2O)

0.2M NaH

2PO

447.5ml (折合

1.482gNaH

2PO

4 2H

2O)

3、1M Tris——Cl（pH

9.0）100ml

称取

12.11gTris——Base（MW

121.1），加水至98ml，用HCI调pH至

9.0.

【步骤】

1、腹水4C, 12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用 4 倍体积的60mM 醋酸缓冲液（pH

4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至

4.5 （一般pH刚好在

4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25卩l/m稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4C静置2h以上，使其充分沉淀。注意：

缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

4、12000r/min , 4C, 30min，收集上清。

5、上清液经普通滤纸过滤1 次，加入体积的10*PBS（

0.1MpH

7.4）用1MNaOH 调至

7.4,冰浴至4C。

6、根据每ml 上述混合液加

0.277g固体硫酸铵（0C条件下，45%饱和硫酸铵为

0.291g/ml），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，不可一次全部加入，而以小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高。缓慢加入时为了避免局部的浓度一下子很高，因为硫酸铵不同的浓度是沉淀不同的蛋白为主，这样就可能将不想沉淀的蛋白沉淀下来。冰浴条件是为了保证蛋白的活性，因为硫酸铵加入到辛酸溶液后会产热。

7、硫酸铵全加入后，再搅拌10-30mi n,使溶液完全平衡，然后就可以进行离心。一般采取4C搅拌30min后，继续静置至少60min （—般过夜）。再

13000r/min , 4C离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS 中。但如果进行下面的亲和层析，可直接将沉淀溶解于

1.5ml 结合缓冲液中。

二、亲和层析

【HiTrap Protein AG HP 1ml（Amersham Bioscienee 特性】柱床体积：1ml

柱子大小：

0.7*

2.5cm

耐受压：

0.3mPa

最大流速：4ml/min

建议流速：1ml/min

【protein G】

G 组链球菌的表面蛋白，属于III 型Fc 受体，能以非免疫机制的方式结合IgG Fc区域。protein G 和IgG在pH

7.0 时有很强的结合能力，而其结合产物的洗脱一般在pH

2.5-3是进行。由于IgG对段敏感，会破坏其生物学活性，故一般在收集管种种加入60-200卩的1MTris-HCI (pH

9.0), —般用100卩l/m洗脱液，这样纯化的IgG最终会中和成中性。注

J八

意：

经pH 洗脱后在收集管内欲置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。

小鼠IgG单克隆抗体溶液在280nm时。

1.44(吸光单位)相当于1mg/ml 。

【缓冲液准备】

1 、结合缓冲液：20mM sodium phosphate。pH

7.0定容至1000ml

称取

7.6024g Na

3PO

4 2H

2O( MW

380.12)，定容置1000ml，调pH 至

7.0.

2、洗脱缓冲液：

0.1M Glycine-HC，l pH

2.71000ml

称取

7.507gGlycine（MW

75.07），定容至1000ml，调pH 至

2.7.

【样品准备】

样品最好用结合缓冲液稀释，上柱前样品过滤（

0.22卩0滤膜）或离心。

【操作步骤】

1、在收集管中加入100 □的1MTris-HCI （pH

9.0）,用于收集1ml的洗脱液。

2、将注射器或泵管充满结合缓冲液。移去柱子上接口的塞子，用适配的接头子将其连接到注射器或者泵管，一“滴对滴“的方式充满柱子后方可以连接，避免空气进入主子。

3、移去柱子下接口的xx,扭断即可。

4、用10ml（10个柱床体积）结合缓冲液洗柱子，流速为1ml/min

5、上样：

用2ml 上样环上样。

6、用5-10ml （5-10个柱床体积）结合缓冲液冲洗柱子,直到流出液中没有杂物质。

7、用2-5ml（5-10个柱床体积）洗脱液进行洗脱。

&纯化产物可以利用Hi Trap Desalting或PD-10柱交换缓冲液。

9、纯化结束后，用20%乙醇保存柱子，防止微生物的生长。