第二章-沉淀法
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沉淀法
2.4.2 有利于结晶的措施 加少量“晶种”； 适当搅拌。
沉淀法
小结：蛋白质沉淀法
• 盐析法：机理 方法：固体法、饱和溶液法、透析法 影响因素：Ks、pH、纯度、浓度等
有机溶剂法：操作注意点
聚乙二醇法：分子量
结晶法：
沉淀法
第三节 核酸的制备
• 思路：从生物材料中分离出DNA-protein（DNP） 或RNA_protein（RNP)－－－解聚－－－去除蛋 白质－－－沉淀核酸
沉淀法
沉淀法
第一节 基本原理与沉淀类型
一、基本原理 沉淀法又称溶解度法，根据各种物质的结构差异，
改变溶液的某些性质，使有效成分的溶解度发生 变化。
沉淀法
二、沉淀法类型 盐析沉淀、有机溶剂沉淀、选择性沉淀
沉淀法
第二节 制备蛋白质（蛋白质沉淀）
2.1 盐析法 2.1.1 机理 盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的增
减少有机溶剂的用量。 pI时，有机溶剂用量最少； 蛋白质分子量越大，沉淀所需的有机溶剂量越少。 对多数酶，沉淀所需的丙酮用量一般为20~50%（体积分数）。
沉淀法
2.3 聚乙二醇沉淀法（polyethylene glycol PEG)
• 机理：PEG为水溶性非离子型聚合物，可用来沉 淀蛋白质。其机理与有机溶剂相似。
沉淀法
3.3 DNA与RNA的分离
3.3.1 盐析法 利用：DNA与RNA在不同NaCl溶液中溶解度不同 DNA：在1－2mol/L NaCl溶液中溶解度较大；
在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度极小。
RNA： 在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度较大； 在1－2mol/L NaCl溶液中溶解度较小。
沉淀法
3.3.2 酶水解法
1、提取DNA 用RNase水解RNA（杂质） 使DNase失活
2、提取RNA 用DNase水解DNA（杂质） 使RNase失活
沉淀法
3.4 核酸沉淀
3.4.1 有机溶剂法 1、乙醇－盐溶液：
沉淀法
2、异丙醇
核酸溶液中－－加入0.3mol/L NaAC和0.54～1倍 体积的异丙醇－－放置短时间－－离心－－核酸 沉淀－－70%乙醇洗涤－－去盐－－真空干燥－ －核酸制品
高而上升的现象。
沉淀法
• 盐析：当盐浓度增高到一定值时，蛋白质的溶解 度逐渐下降，直至蛋白质析出。
沉淀法
1) 盐的选择
• 蛋白质沉淀时，常用（NH4)2SO4
沉淀法
2) （NH4)2SO4盐析
• 固体法：
加入（NH4)2SO4的量：
g＝533(S2-S1） 100-0.3S2
（20°） （S1：原溶液百分饱和度）
2.2.1 机理 有机溶剂浓度增加时，水的活度降低，水对蛋白质
表面的亲水基团的水化程度降低，导致蛋白质分 子聚集而沉淀。
沉淀法
2.2.2加入有机溶剂的量 V＝V0×S2－S1
100-S2
沉淀法
2.2.3 操作注意点
溶剂应预冷 溶剂应与水互溶； 中性盐的作用：起保护作用； 多价阳离子的作用：Zn 2+、Cu2+等降低蛋白质在有机溶剂中的溶解度，
沉淀法
小结：核酸沉淀
• DNP/RNBiblioteka Baidu－－解聚－－去蛋白－－核酸分离、沉淀 解聚：去污剂法、有机溶剂法、蛋白水解酶法 DNA与RNA的分离：盐析法、酶水解法 核酸沉淀：有机溶剂法：乙醇－盐溶液、异丙醇
沉淀法
3.4.2 聚乙二醇（PEG)
1、加PEG－0.5mol/L NaCl溶液于核酸溶液中，－ －－小于2kb的DNA片段沉淀
2、PEG浓度与DNA分子量呈反比 3、操作：沉淀－－－0℃，12hr－－－离心－－－
沉淀溶于0.2mol/L NaCl中－－－乙醇沉淀核酸
沉淀法
3.4.3 CTAB
含多糖较多的核酸溶液中－－加入1%CTAB和 0.35mol/L NaCl－－CTAB－核酸沉淀－－用 0.1mol/LNaAC－70%乙酸洗涤－－离心
沉淀法
C、蛋白质纯度和浓度的影响： D、其他因素的影响： 金属离子：加EDTA－Na2溶液 加（NH4)2SO4时间：2hr加完
沉淀法
5) 脱盐
• 凝胶过滤法： • 透析法： 透析方法：
搅拌下，3hr平衡，样品液：透析液＝1:10； 或静止，过夜，样品液：透析液＝1:20。
沉淀法
2.2 有机溶剂沉淀法
使分层明显； 残留的酚、氯仿用乙醚萃取去除，残留乙醚68°C蒸馏去
除。
沉淀法
3.1.3 加蛋白水解酶
• 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E • 蛋白酶E中含DNase，用前80°C，5min，或
37°C温育0.5~1hr.
沉淀法
3.2 消除多糖杂质
• 选用选择型沉淀剂：异戊醇、十六烷基三甲基溴 化铵（CTAB)
g＝541(S2-S1） （25°）（S2：要达到的百分饱和度） 100-0.3S2
沉淀法
饱和溶液法：
• 加入的饱和（NH4)2SO4溶液的体积：
V＝V0
S2－S1 S3-S2
S3：加入的饱和（NH4)2SO4溶液的饱和度（100％）
沉淀法
透析法
• 方法：将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的 （NH4)2SO4溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶 液中的盐浓度。
蛋白质分子量越大，加入PEG的量越少； 可在室温下操作。 选用PEG分子量为6000和20000。 在pI附近，PEG沉淀效果好； 两价金属离子的存在，可促进蛋白质沉淀。
沉淀法
2.4 结晶沉淀法
2.4.1 操作 在蛋白质溶液中加入适量盐或有机溶剂，使蛋白
质溶解度达到临界浓度； 调pH至pI附近；
沉淀法
3.1 DNP/RNP复合物的解聚 3.1.1 加去污剂法
阳离子去污剂：SDS 其他去污剂：十二烷基肌氨酸钠、DOC、Triton X
－100、Tween 40
沉淀法
3.1.2 加有机溶剂
• 机理：加入苯酚、氯仿等蛋白质变性剂，反复抽 提，上层水相即为核酸制品。
• 操作注意：
加入有机溶剂后，要充分振荡； 苯酚需蒸馏； 加异戊醇混合液（饱和酚：氯仿：异戊醇＝24:24:1），
沉淀法
3) 影响盐析的因素
A、盐析常数Ks的影响： Cohn方程式：lgS=β－Ks×M Ks越大－－△S变化大－－盐析效果好 两种蛋白质组分的分离，还应考虑盐析范围的差异。
沉淀法
B、pH的影响： pH对蛋白质的溶解度影响很大：
除杂质时：pH应接近杂质的pI， 蛋白质沉淀时：pH应接近有效成分的pI。
2.4.2 有利于结晶的措施 加少量“晶种”； 适当搅拌。
沉淀法
小结：蛋白质沉淀法
• 盐析法：机理 方法：固体法、饱和溶液法、透析法 影响因素：Ks、pH、纯度、浓度等
有机溶剂法：操作注意点
聚乙二醇法：分子量
结晶法：
沉淀法
第三节 核酸的制备
• 思路：从生物材料中分离出DNA-protein（DNP） 或RNA_protein（RNP)－－－解聚－－－去除蛋 白质－－－沉淀核酸
沉淀法
沉淀法
第一节 基本原理与沉淀类型
一、基本原理 沉淀法又称溶解度法，根据各种物质的结构差异，
改变溶液的某些性质，使有效成分的溶解度发生 变化。
沉淀法
二、沉淀法类型 盐析沉淀、有机溶剂沉淀、选择性沉淀
沉淀法
第二节 制备蛋白质（蛋白质沉淀）
2.1 盐析法 2.1.1 机理 盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的增
减少有机溶剂的用量。 pI时，有机溶剂用量最少； 蛋白质分子量越大，沉淀所需的有机溶剂量越少。 对多数酶，沉淀所需的丙酮用量一般为20~50%（体积分数）。
沉淀法
2.3 聚乙二醇沉淀法（polyethylene glycol PEG)
• 机理：PEG为水溶性非离子型聚合物，可用来沉 淀蛋白质。其机理与有机溶剂相似。
沉淀法
3.3 DNA与RNA的分离
3.3.1 盐析法 利用：DNA与RNA在不同NaCl溶液中溶解度不同 DNA：在1－2mol/L NaCl溶液中溶解度较大；
在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度极小。
RNA： 在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度较大； 在1－2mol/L NaCl溶液中溶解度较小。
沉淀法
3.3.2 酶水解法
1、提取DNA 用RNase水解RNA（杂质） 使DNase失活
2、提取RNA 用DNase水解DNA（杂质） 使RNase失活
沉淀法
3.4 核酸沉淀
3.4.1 有机溶剂法 1、乙醇－盐溶液：
沉淀法
2、异丙醇
核酸溶液中－－加入0.3mol/L NaAC和0.54～1倍 体积的异丙醇－－放置短时间－－离心－－核酸 沉淀－－70%乙醇洗涤－－去盐－－真空干燥－ －核酸制品
高而上升的现象。
沉淀法
• 盐析：当盐浓度增高到一定值时，蛋白质的溶解 度逐渐下降，直至蛋白质析出。
沉淀法
1) 盐的选择
• 蛋白质沉淀时，常用（NH4)2SO4
沉淀法
2) （NH4)2SO4盐析
• 固体法：
加入（NH4)2SO4的量：
g＝533(S2-S1） 100-0.3S2
（20°） （S1：原溶液百分饱和度）
2.2.1 机理 有机溶剂浓度增加时，水的活度降低，水对蛋白质
表面的亲水基团的水化程度降低，导致蛋白质分 子聚集而沉淀。
沉淀法
2.2.2加入有机溶剂的量 V＝V0×S2－S1
100-S2
沉淀法
2.2.3 操作注意点
溶剂应预冷 溶剂应与水互溶； 中性盐的作用：起保护作用； 多价阳离子的作用：Zn 2+、Cu2+等降低蛋白质在有机溶剂中的溶解度，
沉淀法
小结：核酸沉淀
• DNP/RNBiblioteka Baidu－－解聚－－去蛋白－－核酸分离、沉淀 解聚：去污剂法、有机溶剂法、蛋白水解酶法 DNA与RNA的分离：盐析法、酶水解法 核酸沉淀：有机溶剂法：乙醇－盐溶液、异丙醇
沉淀法
3.4.2 聚乙二醇（PEG)
1、加PEG－0.5mol/L NaCl溶液于核酸溶液中，－ －－小于2kb的DNA片段沉淀
2、PEG浓度与DNA分子量呈反比 3、操作：沉淀－－－0℃，12hr－－－离心－－－
沉淀溶于0.2mol/L NaCl中－－－乙醇沉淀核酸
沉淀法
3.4.3 CTAB
含多糖较多的核酸溶液中－－加入1%CTAB和 0.35mol/L NaCl－－CTAB－核酸沉淀－－用 0.1mol/LNaAC－70%乙酸洗涤－－离心
沉淀法
C、蛋白质纯度和浓度的影响： D、其他因素的影响： 金属离子：加EDTA－Na2溶液 加（NH4)2SO4时间：2hr加完
沉淀法
5) 脱盐
• 凝胶过滤法： • 透析法： 透析方法：
搅拌下，3hr平衡，样品液：透析液＝1:10； 或静止，过夜，样品液：透析液＝1:20。
沉淀法
2.2 有机溶剂沉淀法
使分层明显； 残留的酚、氯仿用乙醚萃取去除，残留乙醚68°C蒸馏去
除。
沉淀法
3.1.3 加蛋白水解酶
• 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E • 蛋白酶E中含DNase，用前80°C，5min，或
37°C温育0.5~1hr.
沉淀法
3.2 消除多糖杂质
• 选用选择型沉淀剂：异戊醇、十六烷基三甲基溴 化铵（CTAB)
g＝541(S2-S1） （25°）（S2：要达到的百分饱和度） 100-0.3S2
沉淀法
饱和溶液法：
• 加入的饱和（NH4)2SO4溶液的体积：
V＝V0
S2－S1 S3-S2
S3：加入的饱和（NH4)2SO4溶液的饱和度（100％）
沉淀法
透析法
• 方法：将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的 （NH4)2SO4溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶 液中的盐浓度。
蛋白质分子量越大，加入PEG的量越少； 可在室温下操作。 选用PEG分子量为6000和20000。 在pI附近，PEG沉淀效果好； 两价金属离子的存在，可促进蛋白质沉淀。
沉淀法
2.4 结晶沉淀法
2.4.1 操作 在蛋白质溶液中加入适量盐或有机溶剂，使蛋白
质溶解度达到临界浓度； 调pH至pI附近；
沉淀法
3.1 DNP/RNP复合物的解聚 3.1.1 加去污剂法
阳离子去污剂：SDS 其他去污剂：十二烷基肌氨酸钠、DOC、Triton X
－100、Tween 40
沉淀法
3.1.2 加有机溶剂
• 机理：加入苯酚、氯仿等蛋白质变性剂，反复抽 提，上层水相即为核酸制品。
• 操作注意：
加入有机溶剂后，要充分振荡； 苯酚需蒸馏； 加异戊醇混合液（饱和酚：氯仿：异戊醇＝24:24:1），
沉淀法
3) 影响盐析的因素
A、盐析常数Ks的影响： Cohn方程式：lgS=β－Ks×M Ks越大－－△S变化大－－盐析效果好 两种蛋白质组分的分离，还应考虑盐析范围的差异。
沉淀法
B、pH的影响： pH对蛋白质的溶解度影响很大：
除杂质时：pH应接近杂质的pI， 蛋白质沉淀时：pH应接近有效成分的pI。