禾谷炭疽菌的遗传转化

禾谷炭疽菌（GLRG）的遗传转化

1、禾谷炭疽菌的分生孢子的准备

1）取活化的禾谷炭疽菌野生型菌丝于PDA培养基， 25℃黑暗培养7d，菌丝长满平板后用于产孢。

2）对禾谷炭疽菌进行产孢，吸取1mL的无菌水于长满炭疽菌菌丝的PDA

培养基中，用提前灭菌的棉签刮断平板上的菌丝，将刮断菌丝的培养皿盖上一

层灭菌的纱布，置于室温中在光照的条件下培养 3-6 d。

3）确认其产孢后，用预先配好的 IM 液体培养基配置孢子悬浮液于

1.5mLEP管中，悬浮液用4 层擦镜纸叠成的小漏斗来过滤。

4）用血球计数板调整孢子浓度，把收集的炭疽菌孢子进行稀释，调整浓度至 1×104个/毫升，孢子悬浮液需要现配现用。

2、农杆菌 AGL-1的诱导转化

1）从-80℃超低温冰箱中取出已经构建好的含有敲除载体的PXEH2.0-GLRG-L1L2菌株进行平板划线，平板中需要加入50μg/mL 利福平和50μg/mL

卡那霉素，在25℃黑暗培养箱中培养2d至长出单菌落。

2）用1μL的微量移液器挑取单菌落于25mL液体LB培养基中，液体LB

培养基中需要加入50μg/mL的卡那霉素和50μg/mL的利福平，将LB培养基放

在28℃摇床中震荡培养48h至OD600为0.1-0.2。

3）吸取800μL已经达到OD值的菌悬液，接种到10mL IM 液体培养基中。

4）将农杆菌的菌悬液和液体IM培养基的混合液放在28℃摇床中，180 rpm，黑暗摇培 6 h至OD600为0.4左右。

3、根瘤农杆菌与禾谷炭疽菌孢子共培养

1）配制IM固体培养基，将90mL的水琼脂用微波炉溶化后，依次加入IM 培养基的各种成分。

2）将IM固体培养基表面铺一层灭过菌的孔径为0.45μm的玻璃纸。

3）将禾谷炭疽菌孢子悬浮液与上述的农杆菌的菌悬液按1:1的比例混合，用微量移液器吸取混合液100μL于玻璃纸的表面，用灭菌涂棒将混合液涂干。

4）在 25℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养 2d。

4、禾谷炭疽菌转化子的筛选与纯化

1）将涂有混合液的玻璃纸从共培养的IM固体培养基上揭下，反向贴于PDA培养基上，PDA中加入潮霉素100 μg/mL，头孢霉素200 μg/mL用于转化

子的初筛。置于25℃恒温培养箱，倒置培养 48h。

2）将玻璃纸从PDA培养基上揭下，在25℃培养箱中黑暗倒置继续培养2d。

3）将长出有扩展的菌丝挑到新的PDA培养基上进行复筛，培养基中潮霉

素100 μg/mL，头孢霉素200 μg/mL，并用微波炉法提取DNA进行PCR验证。4）将验证正确的转化子用滤纸片保存，存于-20℃，用于下一步实验。

各培养基配方：

IM（Induction Medium）诱导液体培养基

IM液体培养基配方

试剂药品名称试剂用量

K-buffer 16µL

M-N buffer 400µL

CaCl2 20µL

FeSO4 200µL

NH4NO3 50µL

Tracelement 200µL

甘油 200µL

MES 800µL

葡萄糖 200µL

As 40µL

H2O 20mL

（注意应当最后加入FeSO4，防止Fe离子被氧化而失效，并且加入各种成分时注意培养基的温度不能太高）

IM（Induction Medium）诱导固体培养基

IM固体培养基配方

试剂名称试剂用量

K-buffer 80µL

M-N buffer 2mL

CaCl2100µL

FeSO41mL

NH4NO3250µL

Tracelement 1000µL

甘油1mL

MES 4mL

葡萄糖4mL

As 200µL

水琼脂90mL

（注意应当最后加入FeSO4，防止Fe离子被氧化而失效，并且加入各种成分时注意培养基的温度不能太高）

MM培养基配方

试剂名称试剂配法

甘油50ml甘油加水定容至100ml

M-N buffer 3g MgSO4▪7H2O，1.5g NaCl加适量水溶解定容到100mL

CaCl2▪2H2O 1g CaCl2▪2H2O加适量水溶解定容100mL NH4NO320g NH4NO3加水定容到100mL

FeSO40.01g FeSO4加水定容至100ml

MES 19.524g MES 加入定容至100ml，调PH=5.5

Tracelement 10 mg Na2MoO4▪2H2O，10mg ZnSO4▪7H2O，1mg CuSO4▪5H2O，10 mg H3BO3，10mg MnSO4▪H2O

葡萄糖20g葡萄糖加水定容至100mL

K-Buffer 8.505g KH2PO4,10.885g K2HPO4加水定容至50mL，调PH=7

AS 0.192g AS加DMSO定容至10ml

FeSO4、MES、Tracelement、葡萄糖过滤灭菌，AS不灭菌，其余均为高温灭菌。

保存方法：AS于-20℃保存，其余均为4℃保存备用。