生物分离工程第四章沉淀分离法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水 区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；
离子强度对盐析过程的影响
• 盐析沉淀平衡式（Cohn经验公式）
loSgKsI β，Ks—常数
• S—蛋白质溶解度，mol/L;
• I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价
I 1
2
ciZi2
β和Ks的物理意义
（二）盐析沉淀法
1. 定义——在高浓度中性盐存在下，使目标产物的
溶解度降低而产生沉淀的过程
2.盐析原理
首先需要了解蛋白质的特性：
是高分子两性电解质，主要由 疏水性不同的氨基酸组成，蛋 白质表面由不均匀分布的荷电 基团形成荷电区、亲水区和疏 水区构成。大部分蛋白质溶于 水，是以亲水胶体的形式或大 分子溶液存在的。
第四章 离心和沉淀分离法
大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发 酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变 化范围很宽。
浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低 至每单位体积仅含0.1%。
粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为 1mm的不溶性物质。
对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物， 我们可以采用过滤方法分离。
二、沉淀分离法
（一）概述
1. 定义——利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶解度降低而
形成无定形固体沉淀的过程 与结晶联系
在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在 化学反应的沉淀或结晶。
区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子 或离子以无规排列形式析出。
2、类型
1) 盐析沉淀法 2) 有机溶剂沉淀法 3) 等电点沉淀法 4) 高分子聚合物沉淀法 5) 金属离子沉淀法
沉淀分离Baidu Nhomakorabea目的：
（1）通过沉淀使目标成分浓缩和去除杂质； （2）通过沉淀将已经纯化的产物由液态变为固态，便于 保存和进一步加工。
沉淀法用于分离纯化应该是是有选择性的，即有选择地沉 淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
沉淀法操作步骤
• 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； • 沉淀物的陈化，促进晶体生长； • 离心或过滤，收集沉淀物；
1) 盐析剂的条件
盐析作用要强：
盐析能力— 阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子
有较大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能小。
盐析用盐必须是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不要引 入不易分离的杂质。
而有些发酵液，使用助滤剂有利于过滤分离，而还有 一些发酵液则不行。
问题
固液分离：第一选择为过滤， 过滤技术难处理的发酵液如何处理？
第二选择离心分离。
离心法与过滤法的比较
比较 项目 离心法
过滤法
浓缩物
悬浮液或 浆体 滤饼
设备
需 专用设备
不需 专用设备
经济 适用性 成本高
成本低
处理量 小
应用 范围
3.盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种 情况：
（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增 大
（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随 之下降，原因如下：
A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对， 部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的 排斥力减弱，从而能够相互靠拢；
蛋白质溶液的稳定性
电荷稳定性： 两性电解质，由于静电斥力的作用，分子间 相互排斥，形成稳定的分散系
空间稳定性： 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子， 避免了相互碰撞，形成稳定的胶体溶液。
可以通过降低蛋白质周围的水电层和双电层厚 度降低蛋白质的稳定性而使蛋白质沉淀。
盐析示意图
破坏水化层 中和电荷
2.在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达 到沉淀的目的，称为“β”分级盐折法。 （ β盐析：固定离子浓度，改变pH ，温度）
由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生 共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。一般 粗提蛋白时常用第1种方法，进一步分离纯化时常 用第2种方法。
4、盐析剂的选择
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
实验室范围
大
实验室
工业范围
离心力：
离心分离原理
Stock’s Force(粘滞吃力)：
离心沉降速度：
分离因子定义Fr：离心力/重力加速度(g)的比值
意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心 机的分类
离心技术分类
按分离因子Fr分类 1)、常速离心机Fr < 3,000g 三足沉降式: 500-1000g 螺旋卸料式：1200-3000g 2)、中速离心机，Fr = 3,000 — 5,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 3)、高速离心机，Fr = 5,000 — 20,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 管式离心机：>8000-15000g 4)、超速离心机，Fr = 20,000 — 1,000,000g
沉淀法的优点：
设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产， 在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高；
沉淀法的缺点：
所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类， 或包裹着溶剂，所以沉淀法所得的产品纯度通常都比结晶法 低，过滤也较困难。 应用沉淀技术分离生化产物的典型例 子是蛋白质(酶)的分离提取，无论是实验室规模还是工业生 产，沉淀法都得到了普遍应用,工业上利用蛋白质溶解度之 间的差异从天然原料如血浆、微生物抽提液、植物浸出液和 基因重组菌中分离蛋白质混合物已有50多年的历史了。
• β—截距常数,与盐的种类无关，但与蛋白
质的种类、温度和pH值有关。(β= log S0)
• Ks—盐析常数，与温度、pH值无关，与蛋
白质和无机盐的种类有关。
经验方程的图示
盐析法分为两种类型
1. 在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度(即离 子强度)达到沉淀的目的，称为“Ks” 分级盐析 法。 （Ks盐析：固定pH ，温度，改变盐浓度）
离子强度对盐析过程的影响
• 盐析沉淀平衡式（Cohn经验公式）
loSgKsI β，Ks—常数
• S—蛋白质溶解度，mol/L;
• I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价
I 1
2
ciZi2
β和Ks的物理意义
（二）盐析沉淀法
1. 定义——在高浓度中性盐存在下，使目标产物的
溶解度降低而产生沉淀的过程
2.盐析原理
首先需要了解蛋白质的特性：
是高分子两性电解质，主要由 疏水性不同的氨基酸组成，蛋 白质表面由不均匀分布的荷电 基团形成荷电区、亲水区和疏 水区构成。大部分蛋白质溶于 水，是以亲水胶体的形式或大 分子溶液存在的。
第四章 离心和沉淀分离法
大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发 酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变 化范围很宽。
浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低 至每单位体积仅含0.1%。
粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为 1mm的不溶性物质。
对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物， 我们可以采用过滤方法分离。
二、沉淀分离法
（一）概述
1. 定义——利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶解度降低而
形成无定形固体沉淀的过程 与结晶联系
在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在 化学反应的沉淀或结晶。
区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子 或离子以无规排列形式析出。
2、类型
1) 盐析沉淀法 2) 有机溶剂沉淀法 3) 等电点沉淀法 4) 高分子聚合物沉淀法 5) 金属离子沉淀法
沉淀分离Baidu Nhomakorabea目的：
（1）通过沉淀使目标成分浓缩和去除杂质； （2）通过沉淀将已经纯化的产物由液态变为固态，便于 保存和进一步加工。
沉淀法用于分离纯化应该是是有选择性的，即有选择地沉 淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
沉淀法操作步骤
• 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； • 沉淀物的陈化，促进晶体生长； • 离心或过滤，收集沉淀物；
1) 盐析剂的条件
盐析作用要强：
盐析能力— 阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子
有较大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能小。
盐析用盐必须是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不要引 入不易分离的杂质。
而有些发酵液，使用助滤剂有利于过滤分离，而还有 一些发酵液则不行。
问题
固液分离：第一选择为过滤， 过滤技术难处理的发酵液如何处理？
第二选择离心分离。
离心法与过滤法的比较
比较 项目 离心法
过滤法
浓缩物
悬浮液或 浆体 滤饼
设备
需 专用设备
不需 专用设备
经济 适用性 成本高
成本低
处理量 小
应用 范围
3.盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种 情况：
（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增 大
（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随 之下降，原因如下：
A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对， 部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的 排斥力减弱，从而能够相互靠拢；
蛋白质溶液的稳定性
电荷稳定性： 两性电解质，由于静电斥力的作用，分子间 相互排斥，形成稳定的分散系
空间稳定性： 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子， 避免了相互碰撞，形成稳定的胶体溶液。
可以通过降低蛋白质周围的水电层和双电层厚 度降低蛋白质的稳定性而使蛋白质沉淀。
盐析示意图
破坏水化层 中和电荷
2.在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达 到沉淀的目的，称为“β”分级盐折法。 （ β盐析：固定离子浓度，改变pH ，温度）
由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生 共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。一般 粗提蛋白时常用第1种方法，进一步分离纯化时常 用第2种方法。
4、盐析剂的选择
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
实验室范围
大
实验室
工业范围
离心力：
离心分离原理
Stock’s Force(粘滞吃力)：
离心沉降速度：
分离因子定义Fr：离心力/重力加速度(g)的比值
意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心 机的分类
离心技术分类
按分离因子Fr分类 1)、常速离心机Fr < 3,000g 三足沉降式: 500-1000g 螺旋卸料式：1200-3000g 2)、中速离心机，Fr = 3,000 — 5,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 3)、高速离心机，Fr = 5,000 — 20,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 管式离心机：>8000-15000g 4)、超速离心机，Fr = 20,000 — 1,000,000g
沉淀法的优点：
设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产， 在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高；
沉淀法的缺点：
所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类， 或包裹着溶剂，所以沉淀法所得的产品纯度通常都比结晶法 低，过滤也较困难。 应用沉淀技术分离生化产物的典型例 子是蛋白质(酶)的分离提取，无论是实验室规模还是工业生 产，沉淀法都得到了普遍应用,工业上利用蛋白质溶解度之 间的差异从天然原料如血浆、微生物抽提液、植物浸出液和 基因重组菌中分离蛋白质混合物已有50多年的历史了。
• β—截距常数,与盐的种类无关，但与蛋白
质的种类、温度和pH值有关。(β= log S0)
• Ks—盐析常数，与温度、pH值无关，与蛋
白质和无机盐的种类有关。
经验方程的图示
盐析法分为两种类型
1. 在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度(即离 子强度)达到沉淀的目的，称为“Ks” 分级盐析 法。 （Ks盐析：固定pH ，温度，改变盐浓度）