基因克隆的酶学基础2014

P OH
b .3’一侧切割形成3’突出末端
5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
PstI切割位点
PstI等产生的3‘粘性末端
5‘ G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3’ 3‘ C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5’
PstI 37
5‘ … G-C-℃T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
第四章 分子克隆的酶学基础
基因的重组与分离，涉及到一系列相互关 联的酶促反应。特别是核酸限制性内切酶 和 DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子的体外 连接与切割成为可能。
核酸限制性内切酶和DNA连接酶是重组 DNA技术赖以创立的重要酶学基础。
重组DNA实验中常使用的酶
① II型核酸内切限制酶 ② DNA连接酶 ③ 大肠杆菌DNA 聚合酶 ④ 反转录酶 ⑤ 多核苷酸激酶 ⑥ 末端转移酶
用其它二价阳离子如 Mn++ 、Cu++、Co++ 或 Zn++ 代替了 Mg++ 。
10、 酶切位点的引入
（1）产生的 5‘ 突出端补平后，再连接可产 生新的酶切位点
（2）同尾末端的连接
不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端再相互连接时，可产生新的 酶切位点，同时原来的酶切位点消失
BamHⅠ（G↓GATCC）+ BclⅠ（T↓GATCA）
EcoB
EcoK
修饰的甲基转移酶 核酸内切限制酶
EcoR I
GAATTC CTTAAG
M EcoR I
限制作用
G3’ 5’ AATTC CTTAA5’ 3’ G
EcoR I
修饰作用
Me GAATTC CTTAAG
Me
核酸内切限制酶EcoR I 及其修饰的甲基化酶MEcoR 的限制与修饰作用
寄主的限制与修饰的作用
增加核酸内切酶的用量,1ugDNA/10u; 扩大反应体积,稀释抑制因素 延长酶切保温时间
(2)甲基化程度:大肠杆菌中的dam甲基化酶在 5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基
(3)缓冲液
pH,Mg2+ ,DTT,BSA,10(X)
(4) 酶切消化反应的温度
大多数为 37℃,少数 25-30℃
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
同裂酶（Isoschizomer): 识别位点的序列相同的限制性 内切酶
完全同裂酶:识别位点和切点完全相同：如MobI和Sau3AI 识别序 列切割位点为 GATC
不完全同裂酶:识别位点相同，但切点不同如AatII(GACGT ↓ C )ZraI(GAC ↓ GTC)
因此
设计 PCR 引物时，引入酶切位点时，在位点之外加上 能够满足要求的碱基数目。
双酶切多克隆位点时选择合适的酶切秩序
7、位点偏爱(site preference)
某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切 割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的 切割效率的现象称作位点偏爱
(1) 现象：
噬菌体 DNA 有 4 个 SacⅡ 位点，三个在中央，一个在右臂，对 中央三个位点的酶切速度快 50 倍
8.II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切， 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时
酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
EcoRⅠ 酶切割 噬菌体中的 5 个位点时并不是随机的，靠近右端 的位点比分子中间的位点切割快 10 倍；
EcoRⅠ 对腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切点的切割速 率也不同。
EcoRⅠ 和 HindⅢ 在 噬菌体 DNA 中的切割速率分别有 10 倍 和 14 倍的差异
2006年2月为止共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
核酸内切限制酶 (restriction endonuclease)
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定 核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA 双链的核酸内切酶
3. 核酸内切限制酶的类型
特性
蛋白质结构 辅助因子 序列特异切割
① 在特异识别序列切割DNA分子； ② 两个单链切割部位在DNA分子上的分布,通常不直接相对； ③ 断片往往具有互补的单链延伸末端。
识别序列
4-8个核苷酸序列
①大部分呈旋转对称、反向重复结构—回文结构
切割位点
C-C-G-C-G-G G-G-C-G-C-C
切割位点 对称轴
A B C C΄ B΄ A΄ A΄B΄ C΄ C B A
甘油浓度高（>5%）
酶过量（>100U/l）
离子强度低（<25mM）
pH 值过高（>8.0）
有机溶剂如 PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基 乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺 （dimethbylformamide）、 sulphalane 等等.
5‘
…
OH
G-C-T-C-T-G-C-A
P
G-G-A-G
…
3’
3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
P OH
5’突出端易于通过DNA激酶和32p ATP进 行同位素标记
3’突出端是末端转移酶的理想作用底物,在 酶的作用下,容易使DNA片段带上多核苷酸 尾
平末端 Blunt ends
A B B΄ A΄ A΄ B΄ A B
② 部分识别序列不对称:
AccBSⅠ :CCG↓CTC GGC↑GAG
BssSⅠ : C↓TCGTG GAGCA↑C
③ 有一些限制酶可识别多种序列 AccI GT MKAC (M:A或C)
HindII GTY RAC(Y:C或R:A或G)
识别位点在DNA分子中的频率
从核酸分子末端开始,一个核苷酸一个核 苷酸地消化降解多核苷酸链,称为核酸外 切酶（ exonuclease）；从核酸内部切割 磷酸二酯键使之断裂为小片段的为核酸内 切酶（endonuclease）。
第一节、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割
1. 寄主控制的限制与修饰现象(R/M)
（Restriction and modification）
a .在对称轴的5’一侧切割底物， DNA双链交错断开，形成5‘突出末端
5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
EcoRI切割位点
EcoRI等产生的5‘粘性末端
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
切割位点
I型酶
II型酶
3种亚基
单一成分
ATP, Mg2+, S-Met
Mg2+
不是Байду номын сангаас
是
距识别序列1kb 识别序列内 处
随机切割 或附近
III型酶
2种不同亚基 ATP, Mg2+, S-Met
是
距识别距离下游 24-26bp处
克隆中的作用
无用
十分有用
用处不大
4. II型核酸内切限制酶的基本特性
(1) 基本特性
EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C …
5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
(2)、 限制性内切酶产生的末端
粘性末端Cohesive ends (Mached ends)
5‘粘性末端, 3’突出末端
平末端 Blunt ends 非对称突出端
①粘性末端Cohesive ends (Mached ends)
DNA分子在限制性内切酶的作用下形成具有互补碱基的单 链延伸末端结构,能够通过互补碱基的配对而重新连接起来.
假定核苷酸随机排列的情况下进行
44=256 46=4096
实践中: 如λ DNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点，
实际上要少一些，如Bgl II只有6个，BamHI只有5个， 而SalI只有2个。
基因组中碱基对的排列是非均匀的 ，尽管有的酶 切序列中 GC 含量相同，但在基因组中出现的
具粘性末端的DNA片段结合方式
6. 核酸内切限制酶的命名法
① 属名头一个字母+种名头两个字母 ② 菌株名 ③ 不同修饰体系 ④ 系统名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 HindIII
DNA 片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同 样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不 同的酶对末端长度的要求是不同。
性
星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限 制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点
ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssH11、EcoRⅠ、 EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、 PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ 和 XmnⅠ 等酶 皆可表现出星星活性。
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH等会使一核酸 内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象
smalI(25℃);ApaI(30℃)
(5)DNA的分子构型