【医学PPT课件】酶免疫测定技术
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第九章 酶免疫技术.ppt
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
2019年10月14
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11
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
竞争法
原理：类似检测抗原的竞争法
应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
2019年10月14
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43
ELISA检测抗体的方法
捕获法
应用：
病原体急性感染诊断中的IgM型抗体
甲型肝炎HAV-IgM抗体
乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
2019年10月14
2019年10月14
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33
2019年10月14
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E EE
E
E
E
E EE
+
2019年10月14
- 双抗体夹心谢谢法你的测阅读抗原
35
ELISA检测抗原的方法
竞争法
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。
应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药
常用酶
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比
2019年10月14
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第八章+酶免疫技术-88页PPT精选文档
第四节 酶免疫测定的应用
• 1．病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊 断。
• 2．蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿 瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。
• 3．非肽类激素测定 如T3、T4、雌激素、绒毛膜 促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状 腺素等。
• 4．药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大 霉素、吗啡等。
酶放大免疫测定技术
克隆酶供体免疫测定 固相酶免疫测定：
酶联免疫吸附试验(ELISA)
液相酶免疫测定
24
一、均相酶免疫测定法
酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。
Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）
双位点一步法检测抗原
固相抗体
标本（含抗原）
底物
E
E
E
酶标抗体
• 在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗
双位点一步法测抗原
E
E
E
பைடு நூலகம்
E
（+）
E
E
（-）
注意事项
如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成 “钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时， 可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当 稀释后重新测定。
竞争法测抗原
E
E
E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（二）检测抗体的方法
1.间接法
将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中 相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物， 再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合， 形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底 物后的显色程度确定待检抗体含量。
酶免疫测定技术
酶免疫测定技术酶免疫测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的生物分析技术，用于检测样品中特定蛋白质或其他分子的存在和浓度。
该技术基于抗原与抗体之间的高度特异性反应，通过酶的催化作用来实现信号放大，从而实现对目标分子的灵敏检测。
一、ELISA的原理ELISA技术主要包括间接ELISA、竞争ELISA、直接ELISA和夹心ELISA等多种变种。
其中，间接ELISA是最常用的一种。
在间接ELISA中，首先将待检样品溶液加入到微孔板中，使得目标分子与固相抗体结合。
然后，通过加入与目标分子特异性结合的二抗，与固相抗体结合。
最后，加入酶标记的二抗，使其与二抗结合，形成“抗原-固相抗体-二抗-酶标记二抗”复合物。
接下来，通过加入底物，使酶催化底物发生可见的颜色反应。
最后，根据反应的颜色强度测定目标分子的浓度。
二、ELISA的应用ELISA技术具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点，因此在医学、生命科学研究、药物开发等领域得到了广泛应用。
1. 医学诊断ELISA技术在临床医学中被广泛应用于疾病的诊断和监测。
例如，ELISA技术可以用来检测人体内的病毒、细菌或其他病原体引起的感染。
通过检测患者体液中的特定抗体或病原体抗原，可以确定疾病的存在和严重程度。
2. 生物学研究ELISA技术在生物学研究中被广泛用于分析细胞因子、激素、细胞表面受体等生物分子的表达和调控。
例如，科研人员可以利用ELISA技术来测定细胞培养液中特定蛋白质的浓度，从而研究其在细胞信号传导、细胞分化和细胞凋亡等生物过程中的作用机制。
3. 药物开发ELISA技术在药物开发过程中发挥着重要的作用。
通过ELISA技术，药物研发人员可以测定药物在体内的药物浓度和药物代谢产物的浓度。
这有助于评估药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性，从而指导药物的优化设计和临床应用。
三、ELISA的优势和局限性ELISA技术具有以下优势：1. 高灵敏度：ELISA技术可以检测非常低浓度的目标分子，通常在纳克/毫升的水平上。
医学免疫学检验-酶免疫技术2精品PPT教学课件
敏感性、特异性、精确性及应用范围
2020/12/6
2
免疫荧光技术 放射免疫技术 免疫酶技术 免疫电镜技术 免疫胶体金技术 发光免疫测定
2020/12/6
3
2020/12/6
免疫标记技术
4
酶免疫技术 Enzyme Immunoassay（EIA）
一、概述
抗原抗体反应＋酶催化反应
肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光 光度计
同一部位呈不同 程度显色
非特异性染色 细胞或间质均匀染 色或更强 无特定部位，无结 构性 无分布规律，某一片 均匀着色
2020/12/6
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非特异性染色：非抗原抗体反应出现的 阳性染色。
原因：非特异性蛋白吸附于高电荷的胶 原或结缔组织上。
2020/12/6
11
2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法
2020/12/6
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（五）固相酶免疫测定仪（酶标仪）
比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检
测速度、震板功能、温度控制、定性和 定量的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、 650nm、405nm
液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育
待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育
2固020/相12/6：固相预先吸附抗原或抗体，在其表面反应18
二 、酶免疫组织化学技术
Enzyme Immunohistochemistry
Technique（EIHCT）
(酶)免疫组织化学（免疫细胞化学）： 指带显色剂（酶）标记的特异性抗体或 抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应 和组织化学的呈色反应，对相应抗原或 抗体进行定性、定位、定量测定的技术。
第八章+酶免疫技术-PPT精品文档88页
竞争法测抗原
E
E
E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（二）检测抗体的方法
1.间接法
将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中 相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物， 再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合， 形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底 物后的显色程度确定待检抗体含量。
间接法检测抗体
酶标二抗
E
E
标本（含抗体）
固相抗原
E
底物
酶标二抗是针对一类免疫球蛋白(如抗人IgG），因此该法只需要变换固 相抗原，即可用一种酶标二抗测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通 用性
间接法测抗体
EE E
EE E
（+）
EE E
（-）
2.双抗原夹心法
将已知抗原包被固相载体，待检标本中的 相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原 结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物， 根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性
酶标记物稳定 ，不易发生解离
制备方法
1.戊二醛交联法
适合各种酶蛋白的标记。
2.过碘酸钠氧化法
常用于HRP标记抗体或抗原
（二）酶标记物的纯化与鉴定
1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游
离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物
对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、 稳定性差，价格贵
第九章 酶免疫技术.ppt
新方法。
2019-11-4
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6
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
2019-11-4
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7
酶和酶作用底物
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
17
酶标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。
2019-11-4
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18
酶标记抗体或抗原
纯化及鉴定
标记完成后应除去反应液中的游离酶、 游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体 或抗原聚合物，避免游离酶增加非特 异显色，以及游离抗体或抗原起竞争 作用而降低特异性染色强度
应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
2019-11-4
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43
ELISA检测抗体的方法
捕获法
应用：
病原体急性感染诊断中的IgM型抗体
甲型肝炎HAV-IgM抗体
乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
2019-11-4
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捕获法
原理：
抗人IgMμ链抗体包被
• 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定， 非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为 液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙 烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）, 其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。
2019-11-4
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6
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
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酶和酶作用底物
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
17
酶标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。
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酶标记抗体或抗原
纯化及鉴定
标记完成后应除去反应液中的游离酶、 游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体 或抗原聚合物，避免游离酶增加非特 异显色，以及游离抗体或抗原起竞争 作用而降低特异性染色强度
应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
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ELISA检测抗体的方法
捕获法
应用：
病原体急性感染诊断中的IgM型抗体
甲型肝炎HAV-IgM抗体
乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
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捕获法
原理：
抗人IgMμ链抗体包被
• 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定， 非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为 液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙 烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）, 其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。
(2)酶免疫测定技术
• • • •
• （2）定量竞争PCR法 PCR反应实质是对特定模板DNA的指
数扩增放大，而在相同的条件下，获得DNA的量与最初模板 DNA的浓度成正相关，竞争定量PCR就是依据这种扩增DNA 与模板DNA之间的浓度相关性设计的。基本原理是先构建含 有修饰过的内部标准DNA片段(竞争DNA)，竞争DNA由质粒 组成，带有一个改造PCR扩增子，改造部分可以是DNA插人 序列、缺失序列或者点突变，竞争DNA与待测目标DNA在同 一反应管中进行PCR共扩增，因竞争DNA片段和待测DNA的 大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开，通过比较两种条带 的量可进行定量分析。
• • • • • •
目前最常用的免疫学检测技术如下： （1）放射免疫测定技术 （2）酶免疫测定技术 （3）荧光免疫测定技术 （4）发光免疫测定技术 （5）胶体金免疫测定技术
• 二、酶联免疫吸附试验(ELISA)
• （一）ELISA的基本原理 • ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基础是抗原 • • • •
• （三）ELISA的材料与试剂 • 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：已包被抗
原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；酶标记的抗原 或抗体（结合物）；酶的底物；阴性对照品和阳性对 照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量 测定中）；结合物及标本的稀释液；洗涤液；酶反应 终止液。 1 免疫吸附剂 2 结合物 3 酶的底物 4 洗涤液 5 酶反应终止液 6 阳性对照品和阴性对照品 7 参考标准品
• （3）PCR检测转基因食品的基本步骤 • ①待检材料DNA提取：通常利用CTAB法
从食品材料中提取核酸； • ②PCR反应：设计合适引物。PCR扩增待 检样品中的靶标DNA； • ③观测PCR产物：通过凝胶电泳分析将 PCR产物展现； • ④确定结果：有时为了避免假阻性，还需 要对PCR产物进行限制性酶切分析进行质量控 制。
酶免疫测定技术PPT课件
乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的 抗原或抗体，一直受到高度重视。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检 测方法， 绝大多数都是ELISA 法。80％ 原发性肝细胞癌患者的， 血清甲胎蛋白（AFP）含量增高。临床借助对AFP的检测作为对原发 性肝细胞癌的辅助诊断。
HIV 抗体初筛：抗体测定必须区分初筛和确认两个步骤, 目前常用的 初筛实验方法为第3 代ELISA试剂, 其敏感性和特异性均可达99%以 上。现已发展到抗原加抗体联合检测第四代试剂, 包被和标记的分别 是HIV1/2 O 抗原和HIV- l P 2 4 抗原的单克隆抗体, 可同时检测 HIV抗原和抗体, 检出时间提前大约七天。
enzymeimmunoassayeia抗原抗体反应的特异性酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定elisa酶免疫增强测定技术emit克隆酶供体免疫分析cedia酶免疫增强技术酶免疫增强技术emitemit克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析cediacedia均相酶免疫测定均相酶免疫测定酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定elisa酶免疫增强测定技术emit克隆酶供体免疫分析cedia酶免疫增强技术酶免疫增强技术emitemit捕获法异相酶免疫测定类型异相酶免疫测定类型10双抗体夹心法双抗体夹心法此法常用于测定抗原适用于多价大分子抗原的检测而不能用于测定半抗原等小分子物质
5
均相酶免疫测定
测定快速、准确、专一、灵敏 试剂稳定 操作过程简便 数据处理简单
6
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 ELISA
HIV 抗体初筛：抗体测定必须区分初筛和确认两个步骤, 目前常用的 初筛实验方法为第3 代ELISA试剂, 其敏感性和特异性均可达99%以 上。现已发展到抗原加抗体联合检测第四代试剂, 包被和标记的分别 是HIV1/2 O 抗原和HIV- l P 2 4 抗原的单克隆抗体, 可同时检测 HIV抗原和抗体, 检出时间提前大约七天。
enzymeimmunoassayeia抗原抗体反应的特异性酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定elisa酶免疫增强测定技术emit克隆酶供体免疫分析cedia酶免疫增强技术酶免疫增强技术emitemit克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析cediacedia均相酶免疫测定均相酶免疫测定酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定elisa酶免疫增强测定技术emit克隆酶供体免疫分析cedia酶免疫增强技术酶免疫增强技术emitemit捕获法异相酶免疫测定类型异相酶免疫测定类型10双抗体夹心法双抗体夹心法此法常用于测定抗原适用于多价大分子抗原的检测而不能用于测定半抗原等小分子物质
5
均相酶免疫测定
测定快速、准确、专一、灵敏 试剂稳定 操作过程简便 数据处理简单
6
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 ELISA
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ß-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8者。 2. 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 3. 温度、时间等
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
五. ELISA出现“一片黄”的原因： ⑴酶结合物浓度过高 ⑵底物不新鲜 ⑶洗涤不干净 六.ELISA出现“一片白”的原因： ⑴载体吸附性能差 ⑵底物错 ⑶稀释液作包被液 ⑷加错试剂 ⑸包被时间过短 ⑹酶活力低或下降 ⑺样品含有NaN3。
第三节 酶标记技术的发展
一、斑点ELISA 二、免疫印迹法 三、重组免疫结合试验 四、亲和素-生物素系统
二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择
三、操作标准化
一、试剂制备：
㈠ 免疫吸附剂
1. 固相载体
2. ⑴ 要求：① 吸附力强
3.
② 能保持Ag或Ab活性
4.
③ 不参与化学反应
5. ⑵ 载体性能比较
6. ① 载体材料：+、- 结果差别大
7. ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG， 显色后，测20孔的OD，要求CV<10%。
底增 加。 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。
试剂的准备：
注意不同地区冬、夏温差，可造成达到 37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大 影响。
加样：
总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特异蛋白
温育：
1 4℃过夜最佳， 37℃2h较好， 2 43℃20min可造成弱“+”假“-” 3 2 水浴较温箱等空气浴均匀
【医学PPT课件】酶免疫测定技术
均相酶免疫测定 ： 1.EMIT(酶扩大免疫测定技术):
位阻
2.克隆酶供体免疫测定 ：
ED Ab
EA ED
ED EALeabharlann 活性酶Ab 标本中Ag
酶联免疫吸附试验(ELISA)
第一节ELISA的原理和类型
一、基本要求：
1. 使Ag(或Ab)结合到某种固相载体表面，并保持 免疫活性。 免疫吸附剂
四、影响ELISA测定的因素：
1 试剂盒因素 2 实验操作中的影响
试剂盒因素：
A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成
(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗 原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)
TMB：水溶性差(商品：配好) E 运输储存
洗板：
手洗效果最佳 自动洗板要注意残留液量。
显色
对HRP，显色完全需30min, 15min只达80%, 易造成弱“+”假“-”
比色：
单波长比色需设空白孔： OD=OD样品-OD空白
双波长比色不需设空白： OD=OD450nm-OD630nm
结果判断： 1 注意夹心法假“-” 2 用cut-off(CO)值判断 3 “灰区”时建议动态观察 4 结合临床用药：例如抑制剂对HBsAg
⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板
2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： ⑴ 包被：将Ag或Ab固相化的过程
包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后在用1~5%小牛血清白蛋白再包
被，以消除非特异吸附的干扰。
㈡ 酶结合物：
操作中的注意事项： 1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断
样品的收集和保存：
1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用 于HRP的辅基)。
2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-” (破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白) 。
3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-”。 4. 陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本
标本
酶标 抗体
底物
显色 有色为阳性
标本
酶标 二抗
底物
显色 有色为阳性
1.夹心法
E
E
底物
固相
标本
2.间接法
酶标抗体
酶标二抗
底物
终止液 显色
标本 固相
显色
3.竞争法
Ag ※ + Ab
Ag(标本) (定量)
Ag※Ab AgAb
第二节 ELISA的技术要点
一、试剂制备 ㈠ 免疫吸附剂 ㈡ 酶标记抗原或抗体
1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性 强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。
2. ELISA常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 酶的底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)
四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm)
5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)
2. 使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性， 又有酶的活性。 酶结合物
3. 标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表 面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有 色反应。 底物
二、必备试剂： 1. 固相的Ag或Ab----免疫吸附剂 2. 酶标记的Ab或Ag----结合物 3. 酶反应的底物-------底物 4. 三、方法类型： 5. 夹心法 6. 间接法 7. 竞争法 8. 捕获法测IgM抗体
鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色：
DAB(棕黄色)
α-萘酚(红色)，
3-氧基-9-乙基卡唑(红色)
4-氯-1-萘酚(灰蓝色)
AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光
Ap不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8者。 2. 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 3. 温度、时间等
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
五. ELISA出现“一片黄”的原因： ⑴酶结合物浓度过高 ⑵底物不新鲜 ⑶洗涤不干净 六.ELISA出现“一片白”的原因： ⑴载体吸附性能差 ⑵底物错 ⑶稀释液作包被液 ⑷加错试剂 ⑸包被时间过短 ⑹酶活力低或下降 ⑺样品含有NaN3。
第三节 酶标记技术的发展
一、斑点ELISA 二、免疫印迹法 三、重组免疫结合试验 四、亲和素-生物素系统
二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择
三、操作标准化
一、试剂制备：
㈠ 免疫吸附剂
1. 固相载体
2. ⑴ 要求：① 吸附力强
3.
② 能保持Ag或Ab活性
4.
③ 不参与化学反应
5. ⑵ 载体性能比较
6. ① 载体材料：+、- 结果差别大
7. ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG， 显色后，测20孔的OD，要求CV<10%。
底增 加。 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。
试剂的准备：
注意不同地区冬、夏温差，可造成达到 37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大 影响。
加样：
总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特异蛋白
温育：
1 4℃过夜最佳， 37℃2h较好， 2 43℃20min可造成弱“+”假“-” 3 2 水浴较温箱等空气浴均匀
【医学PPT课件】酶免疫测定技术
均相酶免疫测定 ： 1.EMIT(酶扩大免疫测定技术):
位阻
2.克隆酶供体免疫测定 ：
ED Ab
EA ED
ED EALeabharlann 活性酶Ab 标本中Ag
酶联免疫吸附试验(ELISA)
第一节ELISA的原理和类型
一、基本要求：
1. 使Ag(或Ab)结合到某种固相载体表面，并保持 免疫活性。 免疫吸附剂
四、影响ELISA测定的因素：
1 试剂盒因素 2 实验操作中的影响
试剂盒因素：
A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成
(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗 原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)
TMB：水溶性差(商品：配好) E 运输储存
洗板：
手洗效果最佳 自动洗板要注意残留液量。
显色
对HRP，显色完全需30min, 15min只达80%, 易造成弱“+”假“-”
比色：
单波长比色需设空白孔： OD=OD样品-OD空白
双波长比色不需设空白： OD=OD450nm-OD630nm
结果判断： 1 注意夹心法假“-” 2 用cut-off(CO)值判断 3 “灰区”时建议动态观察 4 结合临床用药：例如抑制剂对HBsAg
⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板
2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： ⑴ 包被：将Ag或Ab固相化的过程
包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后在用1~5%小牛血清白蛋白再包
被，以消除非特异吸附的干扰。
㈡ 酶结合物：
操作中的注意事项： 1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断
样品的收集和保存：
1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用 于HRP的辅基)。
2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-” (破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白) 。
3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-”。 4. 陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本
标本
酶标 抗体
底物
显色 有色为阳性
标本
酶标 二抗
底物
显色 有色为阳性
1.夹心法
E
E
底物
固相
标本
2.间接法
酶标抗体
酶标二抗
底物
终止液 显色
标本 固相
显色
3.竞争法
Ag ※ + Ab
Ag(标本) (定量)
Ag※Ab AgAb
第二节 ELISA的技术要点
一、试剂制备 ㈠ 免疫吸附剂 ㈡ 酶标记抗原或抗体
1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性 强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。
2. ELISA常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 酶的底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)
四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm)
5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)
2. 使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性， 又有酶的活性。 酶结合物
3. 标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表 面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有 色反应。 底物
二、必备试剂： 1. 固相的Ag或Ab----免疫吸附剂 2. 酶标记的Ab或Ag----结合物 3. 酶反应的底物-------底物 4. 三、方法类型： 5. 夹心法 6. 间接法 7. 竞争法 8. 捕获法测IgM抗体
鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色：
DAB(棕黄色)
α-萘酚(红色)，
3-氧基-9-乙基卡唑(红色)
4-氯-1-萘酚(灰蓝色)
AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光
Ap不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色