血液成分病毒灭活的研究进展_谭美芳

１ 病 毒 灭 活 方 法
１．１ 加 热 法 １．１．１ 湿热法 巴 斯 德 液 态 湿 热 法 最 早 用 于 白 蛋 白 的生产过程中。将液态白蛋白经６０ ℃恒温处理１０ ｈ， ＨＢＶ、ＨＣＶ 和 ＨＩＶ 均可被 灭 活［１］。 巴 斯 德 法 也 应 用 于生产静脉注 射 用 的 丙 种 球 蛋 白 （ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕ－ ｎｅｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＩＶＩＧ），凝 血 因 子 ＦⅧ、ＦⅨ，纤 维 蛋 白 原 （ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ＦＩＢ）等 产 品 的 处 理。 目 前 巴 斯 德 法 主 要 应用于白蛋白和ＩＶＩＧ 的病 毒 灭 活。 该 方 法 能 灭 活 所 有脂包膜病毒和大部分非脂包膜病毒。 １．１．２ 干热法 热 灭 活 法 是 将 冻 干 后 的 制 剂 经 加 热 处理、干 热 杀 灭 病 毒 的 方 法。 Ｍａｎｎｕｃｃｉ等［２］研 究 以
【基 金 项 目 】 广 州 市 科 技 计 划 项 目 （１０Ｃ３６０９１６７１） 【作者单位】 ５１００１０ 广东广州，广州军区广 州 总 医 院 输 血 科 ［谭 美 芳 （广 州 中 医 药 大 学 在 读 硕 士 研 究 生 ）、单 桂 秋 ） 【通讯作者】 单桂秋，Ｅ－ｍａｉｌ：ｒａｂｂｉｔ＿２００７＠１２６．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：０２０－３６６５３４４５
２ 血 液 成 分 的 病 毒 灭 活 方 法
常用 的 血 液 成 分 制 剂 包 括 血 浆、红 细 胞、血 小 板、 冷 沉 淀 等 ，及 从 人 血 浆 蛋 白 成 分 中 分 离 出 来 的 制 剂 ，包 括白蛋白、免疫球蛋白、凝 血 因 子 制 剂 （纤 维 蛋 白 原 浓 缩 剂 、冷 沉 淀 、Ⅷ 因 子 浓 缩 剂 、凝 血 酶 原 复 合 物 、纤 维 蛋 白 胶 ）。 ２．１ 血 浆 的 病 毒 灭 活 方 法
核黄素光化学法可以高效灭活血浆病原体。原理 是它以芳香平面结构插入核酸后，在紫外线 Ａ 或 可 见 光的照射下，通过电 子 转 移 使 核 苷 酸 中 鸟 嘌 呤 碱 基 形 成 共 价 加 成 化 合 物 ，介 导 核 酸 骨 架 链 的 断 裂 ，从 而 灭 活 病毒。目前该方法主要用于血小板制品的细菌和病毒 灭 活 ，美 国 将 其 应 用 于 红 细 胞 悬 液 及 血 浆 的 病 毒 灭 活 。 核黄素在发生光化学反应后的降解产物与外源性核黄 素在人体内正常代谢的产物相同，无残留生物 毒 性 。 ［５］ 核黄素即维生素 Ｂ２ 来源广泛，价格相对便宜，对人 体 无 毒 副 作 用 ，吸 收 光 谱 广 泛 ，可 以 选 择 多 种 光 源 用 于 多 种血液成分的病毒灭活等优势。 １．４ 膜 过 滤 法
光 化 学 灭 活 法 （ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ＰＣＴ） 是目前研究比较热门的病原体灭活方法之一。其灭活 病毒的原理主要是依靠光敏剂在光照下产生自由基或 单线态氧（ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ，１Ｑ２）氧 化 损 伤 病 毒 的 分 子 结构，使病毒的核酸 断 裂、包 膜 破 损，从 而 使 病 毒 完 全 失去穿透、复制及 感 染 能 力。 各 种 光 敏 剂 的 作 用 特 点 不 尽 相 同 ，如 补 骨 脂 内 酯 衍 生 物 主 要 产 生 自 由 基 ，酞 菁 类光敏剂主要产生单 线 态 氧，而 酚 噻 嗪 类 光 敏 剂 亚 甲 蓝（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｌｕｅ，ＭＢ）可 能 同 时 涉 及 两 类 机 制。 目 前 研 究 较 多 的 光 敏 剂 有 ＭＢ、补 骨 脂 素 （ｐｓｏｒａｌｅｎ， ＰＳＯ）及 其 衍 生 物 、核 黄 素 等 。
ＰＳＯ 是一种光敏性化合物，在长波紫外线（ＵＶＡ） 照射时和病毒核酸的 胞 嘧 啶 作 用 形 成 环 状 加 合 物，阻 止核 酸 复 制、转 录，达 到 病 毒 灭 活 的 效 果。ＰＳＯ 加 ＵＶＡ 光 照 法 已 成 功 应 用 于 血 小 板 和 血 浆 的 病 毒 灭 活 ，未 发 现 对 其 功 能 和 生 物 活 性 有 明 显 不 良 影 响 。
免疫球蛋白生产工艺 中 的 低 ｐＨ（ｐＨ＝４）处 理 能
灭活脂 包 膜 病 毒。 该 法 是 ＩＶＩＧ 特 有 的 病 毒 灭 活 方 法 ，该 方 法 可 以 减 少 制 品 抗 补 体 活 性 、避 免 免 疫 球 蛋 白 （ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ，ＩｇＧ）聚 合，保 证 蛋 白 制 品 的 安 全 性。
血浆中含有丰富 的 血 浆 蛋 白、纤 维 蛋 白 原 和 全 部 的凝血因子。血浆的主要用途有用于单纯凝血因子的 补 充 、因 大 量 输 血 伴 有 出 血 倾 向 者 、肝 衰 竭 伴 获 得 性 凝 血障碍者等。在各种 血 液 成 分 中，由 于 一 些 病 毒 颗 粒 可能存在于血浆中，使 血 浆 成 为 病 毒 感 染 危 险 性 较 高 的 一 种 血 液 制 品 。 因 此 ，对 血 浆 进 行 病 毒 灭 活 处 理 ，是 进一步降低输注血浆传播病毒危险性的必要措施。
华南国防医学杂志 ２０１２年１２月２８日 第２６卷 第６期 Ｍｉｌ Ｍｅｄ Ｊ Ｓ Ｃｈｉｎ，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２８，２０１２
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ＭＢ 是一种临床用于亚硝酸盐及氰化物 中 毒 后 解 毒的静脉注射用药。其光化学法病毒灭活技术原理是 与可见光协同作用产 生 单 线 态 氧，作 用 于 核 酸 链 上 的 鸟嘌呤，引起脱嘌呤和核 酸 链 的 断 裂，使 ＤＮＡ 复 制 受 阻。ＭＢ 光化学法是目前临床常用的血浆病毒 灭 活 方 法。该 方 法 可 以 灭 活 大 多 数 脂 质 包 膜 病 毒，包 括 ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ 病毒，但对 非 脂 质 包 膜 病 毒 如 Ｂ１９、 ＨＡＶ 杀灭效果不理想。
８０ ℃ 处理７２ ｈ的凝血因子冻干制剂，经３５例临床使 用没有发生 ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ 感染。 １．２ 有 机 溶 剂／去 污 剂 法
有机溶剂／去 污 剂 （Ｓ／Ｄ）法 通 过 破 坏 脂 包 膜 病 毒 的脂膜来达到去除病毒的效果。其常用的病毒灭活条 件：１ ％ 磷 酸 三 丁 酯 （ｔｒｉｂｕｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＴＮＢＰ）和 １％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００在２４ ℃ 处理４ ｈ，或用１％Ｔｗｅｅｎ－８０ 处理≥６ ｈ。 国内外的研究均证明了 Ｓ／Ｄ 法对脂包膜 病毒的灭活效果最好，但 对 非 脂 包 膜 病 毒 如 甲 肝 病 毒 （ｈａｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ，ＨＡＶ ）、细 小 病 毒Ｂ１９ 无 灭 活 作 用。Ｈｏｒｏｗｉｔｚ等 报 ［３］ 道用加热、Ｓ／Ｄ 法 对 血 浆 及 其 衍 生物进行病 毒 灭 活，其 中 Ｓ／Ｄ 法 处 理 血 浆 已 在 美 国、 西欧临床常规应用。Ｂｕｒｎｏｕｆ等 研 ［４］ 究经 Ｓ／Ｄ 法 处 理 后的血浆蛋白质量 合 格，回 收 率 高，制 备 技 术 简 单，有 利于大规模生产和临床应用。但是混合血浆处理和单 袋血浆病毒灭活比较也有不利的一面。当混合多袋血 浆 处 理 时 ，其 中 只 要 有 一 袋 病 毒 污 染 的 阳 性 血 浆 时 ，会 导致混合 血 浆 的 病 毒 污 染，严 重 威 胁 到 患 者 的 安 全。 因此 Ｓ／Ｄ 法病毒灭活血浆尚未在国内大规模应用。 １．３ 光 化 学 法
DOI:10.13730/j.1009-2595.2012.06.035
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·综述·
华南国防医学杂志 ２０１２年１２月２８日 第２６卷 第６期 Ｍｉｌ Ｍｅｄ Ｊ Ｓ Ｃｈｉｎ，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２８，２０１２
血液成分病毒灭活的研究进展
谭 美 芳 ，单 桂 秋
【关 键 词 】 血 液 成 分 ；光 化 学 法 ；病 毒 灭 活
Ｎａｋａｇａｍｉ等 研 ［６］ 究 发 现，２５ ℃ 时 用 ４００ＭＰａ 高 压处理血浆中的 ＨＩＶ－１病毒１０ ｍｉｎ，病毒滴度可降低 ５个数量级，而 对 一 些 血 浆 蛋 白 质 的 生 物 活 性 没 有 影 响，如 凝 血 因 子 Ⅸ 和 γ－球 蛋 白 的 回 收 率 为 １００％。 Ｂｒａｄｌｅｙ等 发 ［７］ 现超 高 压 技 术 可 以 灭 活 血 浆 和 蛋 白 制 品中的病毒。 １．６ 低 ｐＨ 孵放法
美国 食 品 药 品 监 督 管 理 局 （Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄ－ ｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ）已批 准 将 Ｓ／Ｄ 法 灭 活 病 毒 的 血 浆 应用于临床。Ｓ／Ｄ 法处理血浆是 将 少 于 ２５００（人）份， ＡＢＯ 血型同型的血浆混合冰冻，以保存凝血因子的活 性，再融化后与１％ＴＮＢＰ 和１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００混合，在 ３７ ℃ 孵 育 ４ ｈ 灭 活 脂 包 膜 病 毒。 经 植 物 油 萃 取 和 Ｃ１８层析柱去除血浆中的 Ｓ／Ｄ 因子，再用滤膜无菌过 滤分装冰冻保存。Ｓ／Ｄ 法灭活病毒血浆含有的凝血因 子与新鲜 冰 冻 血 浆 （ｆｒｅｓｈ ｆｒｏｚｅｎ ｐｌａｓｍａ，ＦＦＰ）相 似， 其中凝 血 因 子 Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ 不 低 于０．７ ＩＵ／ｍｌ。 王 剑 峰等 研 ［８］ 究 表 明，Ｓ／Ｄ 法 对 两 种 核 酸 类 型 的 脂 包 膜 病 毒水疱性口炎 病 毒 （ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ） 和伪狂犬病 毒 （ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）有 良 好 的 灭 活效果。莫琴等 研 ［９］ 究巴斯德法用于原料血浆病 毒 灭 活 的 可 行 性 和 灭 活 效 果 ，结 果 表 明 ，血 浆 在 加 有 保 护 剂 的条件下，６０ ℃恒温３ ｈ即可灭活 Ｓｉｎｄｂｉｓ和 ＶＳＶ 病 毒，６０ ℃恒温１０ ｈ可有效灭活血浆中的病毒。
纳米膜过滤可以有效地去除一些表面直径较小的 病毒如 ＨＡＶ 和细小病毒 Ｂ１９等。它利用蛋白质和病 毒的大小差异及滤膜 对 病 毒 的 吸 附 来 分 离 病 毒，可 以 有效去除血液中的朊 病 毒，进 行 高 浓 度 的 蛋 白 病 毒 分 离，适用于所有的 血 浆 制 品。 研 究 发 现 纳 米 膜 过 滤 并 不能完 全 清 除 免 疫 球 蛋 白 中 的 ＨＣＶ 病 毒，纳 米 膜 有 良 好 的 病 毒 去 除 能 力 ，但 不 能 作 为 单 独 的 病 毒 灭 活／去 除步骤使用。为了确 保 血 液 制 品 的 安 全 性，生 产 工 艺 中通常采用多种不同机制的方法联用，如结合 Ｓ／Ｄ、低 ｐＨ 法、巴氏法等技术使用。 １．５ 超 高 压 技 术